茶皂素提取纯化及其与山梨酸钾复配的抑菌防腐效果

对照组，每隔2 d分别取1次样液检测其细菌总数和挥发性盐基氮含量，测定5次。菌落总数的检测方法按照GBT4789.2—2010，采用平板倾注法对试样的菌落总数进行测定，采用lgCFU/g表示检测的结果；试样挥发性盐基氮（TVB-N）的检测方法采用半微量定氮法，结果以 mg/100 mL 表示[13]。

2结果与分析

2.1微波-超声波辅助单因素浸提茶皂素试验

2.1.1乙醇浓度对茶皂素浸提得率的影响按“1.3.1”节的方法，在液料比为8 mL ∶1 g，超声波功率为70 W，浸提时间为50 min的条件下考察乙醇浓度对茶皂素浸提得率的影响，结果如图1所示。茶皂素浸出浓度随乙醇浓度增大而增大，在乙醇浓度为70%时，茶皂素浸出浓度达到最大值。但随乙醇浓度进一步增大，茶皂素浸出浓度略有降低。因此取乙醇的体积浓度70%为适宜的浸提液浓度。

2.1.2液料比对茶皂素浸提得率的影响在乙醇体积分数为70%，超声波功率为70 W，浸提时间为50 min的条件下，按“1.3.1”节的方法，考察不同液料比对茶皂素浸提得率的影响，结果如图2所示。随料液比增大，茶皂素浸提得率随之增大，料液比超过10 mL ∶1 g后，茶皂素浸提得率随料液比的增大而略有增加。为了避免溶剂的浪费且降低茶皂素干燥的能源，因此取料液比10 mL ∶1 g较为适宜。

2.1.3超声波功率对茶皂素浸提得率的影响在乙醇体积浓度为70%，料液比为10 mL ∶1 g，浸提时间为50 min的条件下，按“1.3.1”节的方法，考察不同超声波功率对茶皂素浸提得率的影响，结果如图3所示。由图3可知，随超声波功率增大，茶皂素浸提率随之增大，但超声波功率达到80 W后，超声波功率进一步增大，茶皂素浸提得率稍许降低，可能是浸提液在超声功率80 W时，超声波的空化趋于饱和，此时进一步增大超声波强度反而降低了空化强度，对茶皂素浸提得率的提高反而不利。因此，取80 W为适宜的超声波功率。

2.1.4浸提时间对茶皂素浸提得率的影响在乙醇体积浓度为70%，料液比为10 mL ∶1 g，超声波功率为80 W条件下，按“1.3.1”节的方法，考察不同浸提时间对茶皂素浸提得率的影响，结果如图4所示。由图4可知，茶皂素浸提得率随浸提时间的延长而提高，浸提80 min，茶皂素浸提得率达到最大值，进一步延长浸提时间，茶皂素浸提得率反而略有降低。主要是因为在浸提 80 min 时，茶皂素溶出达到平衡，继续延长浸提时间，茶籽粕粉中的多糖、蛋白质等水溶性杂质与茶皂素溶出产生竞争，抑制茶籽粕粉中茶皂素的溶出[7]，所以引起茶皂素浸提得率略有降低。因此，取80 min为适宜的浸提时间。

2.2响应面法优化微波-超声波辅助浸提茶皂素工艺条件

以茶皂素浸提得率为响应值，茶籽粕粉提取茶皂素的乙醇浓度、液料比、超声波功率和浸提时间为自变量。在单因素试验的基础之上，通过Box-Behnken优化茶籽粕粉提取茶皂

素的工艺条件，设计的因素与水平见表1；按Box-Behnken优化的浸提条件进行茶皂素的提取试验，测得不同提取条件下茶皂素的浸提得率，结果见表2；对茶皂素提取的试验结果进行回归分析，结果见表3；回归方程的残差正态概率分布图见图5。

由表3模型的F值=4.27，表明模型是显著的，由P值分析可知A、B、C、D 4个因素对模型的影响显著；A、C，C、D双因素对模型的交互影响显著；A、C、D 3个因素的平方项对模型的结果影响显著。对

由失拟项P值的数值为0.594 1，为不显著，方程的R2=0.987 3，图5中回归方程的残差正态图呈一条直线，说明回归分析得到的方程拟合程度好，可信度高，可以通过拟合的方程预测茶皂素浸提得率。考虑到A、C，C、D双因素对模型的交互影响显著，因此本研究考察A、C，C、D双因素交互影响的响应面曲线及对应的等高线图，其结果如图6、图7所示。

由图6因素A、C响应面分析立体图及相应等高线图可知乙醇浓度在72%～75%、超声波功率在78～82 W的区间范围内可达到响应面顶点，等高线图中出现圆心区间，表明在这个范围内响应值有出现最优点；由图7因素C、D响应面分析立体图及相应等高线图可知，响应面顶点值出现在因素C、D较大的交互区间，在等高线图上出现较大的椭圆心区，表明因素C、D对响应值茶皂素浸提得率的交互影响更显著。

通过响应面法对表2试验结果进行最优化，获得微波-超声波辅助从茶籽粕粉浸提茶皂素的最优工艺：700 W功率微波辐射2 min条件下，乙醇浓度为72.35%、液料比为 11 mL ∶1 g、超声波功率为78.68 W、浸提时间为 75.83 min。

在最优条件下，响应面法预测获得的茶皂素浸提得率为13.82%。

2.3响应面法优化微波-超声波辅助浸提茶皂素工艺条件的验证

对响应面法优化微波-超声波辅助浸提茶皂素工艺条件的可靠性进行验证，700 W功率微波辐射2 min条件下，取乙醇浓度为72%、液料比为11 mL ∶1 g、超声波功率为 79 W、浸提时间为76 min，从茶籽粕粉微波-超声波辅助浸提茶皂素，平行试验5次，结果取平均值，测得茶皂素浸提得率為 （13.5±0.2）%，干燥后测得其纯度为68.2%。与预测值的相对误差为2.2%，表明响应面法建立茶皂素浸提得率的模型可信度高，能够指导从茶籽粕粉中采用微波-超声波辅助浸提茶皂素。

2.4反相柱层析纯化后茶皂素的表征

对提取、干燥获得的茶皂素进行反相柱层析纯化，纯化后样品的红外吸收光谱如图8、紫外吸收光如图9所示。

由图8可见，在2 920、2 850 cm-1处出现茶皂素烷烃配基的C—H伸缩振动吸收峰。在1 610 cm-1处出现CC伸缩振动吸收峰，在1 385 cm-1处出现—OH伸缩振动吸收峰，在1 075、1 045 cm-1与处出现C—O伸缩振动强吸收峰，与文献报道的茶皂素红外光谱值[14]基本一致。由图9可见反相柱层析纯化后的样品在紫外吸收光区仅于波长215 nm处有最大吸收峰，与文献[15]相符，在波长230 nm后没有出现明显的吸收峰，表明茶皂素提取物中的单宁、黄酮等杂质得到了有效的分离，测得纯化后的样品纯度达99.2%。

2.5茶皂素与山梨酸钾复配防腐剂对龙岩泡鸭爪的抑菌防腐作用

茶皂素与山梨酸钾复配防腐剂对龙岩泡鸭爪的抑菌防腐作用可通过泡鸭爪样液稀释培养的细菌总数（lgCFU/g）及样液挥发性盐基氮（TVB-N）这2个指标进行评价，A、B、C、D、E以及对照组F共6个样的细菌总数（lgCFU/g）及挥发性盐基氮（TVB-N）随试样保存时间（d）的变化如图10、图11所示。

由图10可见，0.020 0 g/kg山梨酸钾样液浸泡的泡鸭爪在保存到10 d后菌落已经蔓延，茶皂素与山梨酸钾复配比对泡鸭爪试样的抑菌效果比单独使用山梨酸钾作防腐剂的抑菌效果要好，随复配方中茶皂素含量增大，抑菌效果增强；由图11可见，泡鸭爪在相同保存天数，茶皂素与山梨酸钾复配可大幅降低泡鸭爪挥发性盐基氮的含量，復配方中茶皂素含量达到60 mg/mL时，复配方中进一步增加茶皂素含量对泡鸭爪中挥发性盐基氮含量的降低基本没有影响。结果表明茶皂素与山梨酸钾复配使用对龙岩风味泡鸭爪的防腐抑菌起协同作用，可延长泡鸭爪的保质期。

3结论

通过响应面法优化微波-超声波协同辅助提取茶皂素，

得到浸提最优工艺：微波功率700 W，辐射2 min条件下，乙醇浓度为72%、液料比为11 mL ∶1 g、超声波功率为79 W、浸提时间为76 min。在最优条件下茶皂素浸提得率为 （13.5±0.2）%，干燥后测得其纯度为68.2%；通过反相柱层析纯化提取的茶皂素，可得到纯度为99.2%的茶皂素；茶皂素与山梨酸钾复配使用对龙岩风味泡鸭爪的防腐抑菌起协同作用，可延长泡鸭爪的保质期。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.050

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