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1.2 抗氧化酶活性测定
水培处理72 h后，分别取根、剪口、茎、叶样品0.2 g于预冷的研钵中，分3次加入1.6 mL（0.6，0.5，0.5 mL）50 mmol·L-1预冷的磷酸缓冲液（pH 7.8），经冰浴研磨成匀浆，转入离心管中，4 ℃ 12 000×g下离心20 min，上清液即为酶粗提液。超氧化物歧化酶活性（SOD）测定采用氮蓝四唑法;过氧化物酶活性（POD）测定采用愈创木酚法;过氧化氢酶活性（CAT）测定采用过氧化氢法，抗坏血酸过氧化物酶活性（APX）测定采用抗坏血酸法[20]。
1.3 光合参数测定
水培处理72 h后，取每个处理的每株三七的中叶，用Yaxin-1101型光合作用测定仪测定光合生理指标，主要包括净光合速率（Pn，μmol·m-2·s-1）、蒸腾速率（Tr，mmol·m-2·s-1）、气孔导度（Gs，mmol·m-2·s-1）和胞间CO2浓度（Ci，μmol·mol-1，测定时段为8：00—18：00，每2 h测定1次，取6次测量的平均值。
1.4 Cd元素的测定
水培处理72 h后收获三七，将根系浸泡在20 mmol·L-1的乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶液中20 min，再用去离子水洗净，置于烘箱中以60 ℃烘干。根据《中国药典》（2010年版） [21]一部附录ⅨB镉的测定方法，准确称取植物样0.1 g用硝酸-高氯酸（4∶1）混合酸10 mL加盖小漏斗浸泡过夜后，于电热板上消解至白烟冒尽，用2%稀硝酸定容至10 mL，同时制备空白。所有仪器均用1∶5硝酸浸泡过夜后用自来水冲洗，再去离子水冲洗3次。采用石墨炉原子吸收光谱仪（Savant AA Z）测定Cd含量，并计算富集系数与转移系数。
富集系数=器官镉含量/培养液中镉含量
转移系数=地上部镉含量/地下部镉含量
1.5 数据分析
所有数据均采用Microsoft Excel 2010 进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 Cd胁迫对三七各器官抗氧化酶活性影响及各酶比值变化
2.1.1 Cd胁迫对三七各器官抗氧化酶活性影响 镉胁迫下三七各器官抗氧化酶活性变化见表1。随镉处理浓度的升高，三七各器官SOD活性均呈先升后降的变化趋势，但各器官SOD对镉的响应浓度存在显著差异，如2.5 μmol·L-1处理下叶片、茎、剪口SOD活性最大，而根的SOD活性在5 μmol·L-1处理时最大。与对照相比，镉处理后各器官CAT活 性显著降低，其中叶片CAT活性下降幅度最大，为92.38%;剪口CAT活性降幅最小，为58.01%。叶、茎、剪口的APX活性均呈先上升后下降的变化趋势，其中叶片APX活性在镉浓度为2.5 μmol·L-1时最高，茎与剪口的APX活性在镉浓度为5 μmol·L-1时最高。与对照相比，根中APX活性显著降低，虽然在镉浓度为5 μmol·L-1时APX活性有小幅上升，但仍未达到空白处理水平。各器官中POD活性均随镉浓度的升高而呈先升高后降低的变化趋势。镉浓度为2.5 μmol·L-1时，叶、茎和剪口的POD活性最高，分别为对照的1.94，1.94，2.48倍。主根POD活性在5 μmol·L-1镉处理下最高，为对照的15.71倍。可见，镉胁迫能够诱导三七各器官抗氧化酶活性的改变，但各器官对镉的响应浓度不一，其中叶、茎和剪口的敏感浓度为2.5 μmol·L-1，根的敏感浓度为5 μmol·L-1，见表1。
2.1.2 Cd胁迫诱导的三七各器官抗氧化酶比值变化 叶片中CAT/SOD值随镉处理浓度的上升而持续下降;APX/SOD和POD/SOD值则先上升后下降，并在镉处理浓度为2.5 μmol·L-1时最大。茎中CAT/SOD值亦随镉处理浓度上升而持续下降;APX/SOD值则先随镉处理浓度上升而先降后升，镉处理浓度为2.5 μmol·L-1时最低;POD/SOD值变化则与前者相反，呈随镉处理浓度上升而先升后降的趋势。剪口和根中CAT/SOD值呈先降后升变化趋势，5 μmol·L-1处理时CAT/SOD值最低;而APX/SOD的最低值则分别为2.5，5 μmol·L-1镉处理;POD/SOD值变化呈先升后降趋势，其中剪口最大值为2.5 μmol·L-1处理，根的最大值为5 μmol·L-1处理。说明，镉不仅能影响三七各抗氧化酶的活性，还能影响整个抗氧化酶系统的协调性，见表2。
2.2 Cd胁迫对三七光合系统影响
Cd胁迫对三七光合系统影响见表3。随镉处理浓度的升高，三七叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度均呈持续下降趋势，胞间CO2浓度则呈先下降后上升之趋势。说明镉胁迫对三七光合系统产生显著影响。
2.3 不同处理浓度下三七各器官Cd含量及富集系数
2.3.1 镉胁迫后三七各器官Cd含量 三七各器官Cd含量见表4，随着镉处理浓度升高，三七各器官中镉含量也随之显著升高。其中，须根中镉含量的上升幅度最大，为对照处理的68.69倍，茎的上升幅度最小，为对照处理的2.40倍。说明三七对镉具有较强的吸收能力，但各器官存在显著差异，表现为须根>剪口>主根>叶片>茎。
2.3.2 三七各器官镉富集系数及转移系数 三七各器官镉富集系数均随镉处理浓度的上升而下降，5个部位中以须根对镉的富集能力最强，富集系数高达95.20，茎对镉的富集能力最弱，富集系数为0.57。三七中镉的迁移系数表现为随镉处理浓度的上升而上升。说明三七对镉具有较强的富集能力，且不同器官具有显著差异，见表5。
2.4 镉处理浓度与各器官镉含量及光合参数的相关性分析
三七叶、茎、剪口中镉含量与镉处理浓度呈显著正相关，相关系数分别为0.99，0.98，0.99（P均<0.05），说明环境中镉含量对三七叶、茎、剪口镉含量具有显著影响。镉处理浓度与蒸腾速率和气孔导度呈极显著相关，与净光合速率呈显著相关，相关系数分别为0.89（P<0.05），0.97（P<0.01），0.86（P<0.01），说明三七蒸腾速率、气孔导度和净光合速率显著受环境中镉浓度影响。可见，环境中镉含量对三七各器官镉含量具有直接影响，进而影响光合作用。
3 讨论
本试验中，三七在低浓度镉胁迫下（2.5 μmol·L-1）SOD，APX，POD活性均上升，说明低浓度镉胁迫即诱导各器官产生氧自由基。为维持活性氧代谢平衡，保护膜结构稳定，三七通过提高抗氧化酶活性或合成更多的抗氧化酶以消除自由基，降低镉胁迫损伤，从而在一定程度上提高对镉胁迫的耐性。当镉浓度超过5 μmol·L-1时，各酶活性则呈下降趋势，说明该浓度超过三七对镉胁的耐受阈值，该处理浓度下的三七抗氧化酶系统受到了破坏，活性下降，脂膜过氧化作用也随之加剧，细胞代谢紊乱，最终抑制三七正常的生长发育。
本研究中低浓度镉（2.5 μmol·L-1）胁迫下POD/SOD值升高，当浓度超过5 μmol·L-1时则下降，APX/SOD则继而上升，说明在受到镉胁迫时，H2O2的清除工作主要由POD承担，而过高的镉胁迫会造成POD活性降低，为维持正常的H2O2代谢，其他同工酶如APX等则会协同作用，所以此时APX/SOD值会小幅上升。就4种酶活性变化程度看，CAT持续下降，说明镉对CAT产生较大的抑制作用。就三七各器官而言，叶片中SOD和CAT活性下降幅度较其他器官中更大;其APX酶活性最高值对应镉处理浓度为2.5 μmol·L-1，显著低于其他器官APX酶活性最高值对应的5 μmol·L-1的镉处理，说明叶片对镉最为敏感，对镉的耐受性最低;主根中各酶的镉敏感浓度均显著高于其他器官，说明主根对镉的耐受性强于其他器官，这可能是由于主根与环境直接接触，必须有较高的抗胁迫能力才能确保植物的正常生长有关。
本试验中，当镉处理浓度为0～5 μmol·L-1时，三七叶片Pn，Tr，Gs，Ci均随镉处理浓度的升高而降低，说明此时光合速率主要由气孔因素决定，低浓度的镉可以通过降低气孔导度而抑制蒸腾作用，以达到减少水分蒸发，维持植株正常渗透压而抵御胁迫的目的，气孔导度的减低会使胞间CO2浓度下降，继而抑制其光合速率。而当镉处理浓度达到10 μmol·L-1时，虽然Pn，Tr，Gs依然下降，但Ci反而上升，说明此时光合速率主要受到非气孔限制因素影响。这是由于高浓度镉处理造成了三七脂膜过氧化，细胞受损，光合作用受到抑制，固定CO2的能力减弱，从而使胞间CO2浓度升高。Pn，Tr，Gs与镉处理浓度的极显著相关性也表明环境中镉浓度是造成这三者下降的关键因素。这与孙晓灿等[22]发现的秋华柳在低浓度镉处理下光合速率受气孔限制因素影响，高浓度处理下光合速率受非气孔限制因素影响一致。
本研究中，三七叶片、茎、剪口、须根和主根的镉富集系数均随镉处理浓度的升高而降低，不同器官表现为须根>剪口>主根>叶片>茎，说明不同的部位对镉的富集能力不同，茎富集镉能力最弱，须根最强，该结果与陈璐等[6]野外调查结果一致。这可能是由于茎为疏导组织，不能贮存镉，而须根表面积大，又是直接吸收部位，故其结合态和吸附态镉含量均较高。但该结论与朱美霖等[10]得出的三七茎对镉的富集能力最强的结果相反，这可能是由试验方法差异造成的，仍需深入论证研究。综合比较地上部镉含量、富集系数与地下部镉含量、富集系数，地下部对镉的富集能力大于地上部，说明三七中镉主要分布于地下部分。三七的地下部为主要药用部位，其富集镉能力较大的生物学特性对保障药材安全极为不利，因此寻求镉低吸收品种是解决该问题的有效途径之一。同时本研究也可发现，地下部镉富集系数整体较高主要由毛根的镉富集系数较高引起，因此尽量减少毛根用药是降低重金属镉风险的重要手段。各部位镉含量与镉处理浓度的相关分析表明叶、茎、剪口的镉含量与镉处理浓度均呈显著正相关，说明该三器官中的镉含量受环境中镉含量影响，而毛根中镉含量偏高可能主要受吸附态镉含量较高影响。本研究中，虽然迁移系数随镉处理浓度上升而上升，但镉胁迫下的迁移系数低于空白对照组，且地上部镉含量增加的幅度明显小于地下部，说明在三七对镉的耐受机制主要是镉在根中因区域化、络合合作用等而运输困难，从而减少其对地上部的转运，降低对三七的毒害[23]。
综上所述，低浓度镉胁迫能启动三七活性氧防御系统，高浓度镉则会造成该机制紊乱;镉胁迫还能抑制三七光合作用。三七对镉具有富集作用，因此应选择种植土壤中镉含量较低的地块作为三七栽培基地。应通过合理用药方式减少三七药材镉毒害，如针对三七镉富集能力表现为须根>剪口>主根>叶片>茎这一特性，应尽量减少对须根的使用，加强剪口作为皂苷提取物原料，将主根作为饮片原料。
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[责任编辑 吕冬梅]