[摘要] 目的 分析细菌感染诊断中应用PCR与RFLP方法快速诊断的价值。 方法 将已知菌7株与2013年1月—2017年12月临沂市第三人民医院接诊的临床确诊为生殖道炎症病变35例患者的标本作为研究对象，均进行PCR与RFLP方法快速诊断，将快速诊断结果与临床诊断进行比较。 结果 PCR诊断已知菌阳性率为85.71%（6/7），而PFLP诊断均为100.00%；已知菌的PCR扩增产物酶切片片段长度实验结果与RFLP电子克隆结果基本一致，差异无统计学意义（χ2=1.004 8、2.005 1、3.011 6、3.045 2，P>0.05）。結论 相比传统细菌培养法诊断细菌感染，PCR与RFLP方法快速诊断有着快速、灵敏、准确等优势，可以明显缩短诊断时间，可直接鉴定临床标本，值得借鉴。
[关键词] 细菌感染；生殖道炎症；PCR；RFLP；价值；分析
[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）06（b）-0014-03
Analysis of Application of PCT and RFLP Method in Rapid Diagnosis of Bacterial Infection and Its Clinical Value
SHAO Hua
Department of Clinical Laboratory， People"s Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone & Linyi Third People’s Hospital， Linyi， Shandong Province， 276000 China
[Abstract] Objective To analyze the application of PCT and RFLP method in rapid diagnosis of bacterial infection and its clinical value. Methods 7 strains of know bacterial and 35 cases of patients with inflammatory lesions of the genital tract confirmed by our hospital from January 2013 to December 2017 were selected as the research objects for PCR and RFLP rapid diagnosis， and the rapid diagnosis results and clinical diagnosis results were compared. Results The positive rate of known bacterial diagnosed by PCR， and positive rate of PFLP diagnosis were respectively 85.71%（6/7） and 100.00%， and the fragment length of the PCR amplified products of the known bacteria was basically consistent with the results of RFLP electron cloning， the difference was not statistically significant（χ2=1.004 8， 2.005 1， 3.011 6， 3.045 2， P>0.05）. Conclusion The PCR and RFLP rapid diagnosis is rapid， sensitive and accurate compared with the traditional germiculture in diagnosis bacterial infection， which can obviously shorten the diagnosis time and directly identify the clinical specimens， and it is worth reference.
[Key words] Bacterial infection； Inflammation of the genital tract； PCR； RFLP； Value； Analysis
生殖道炎症属于比较常见的多发性疾病，这种疾病多因细菌感染所致，尽早诊断与治疗是防治关键。微生物感染常用的诊断方式为分离培养及鉴定，尽管准确率高，但其比较耗时，方法也相当繁琐[1-3]。为了探讨这种快速方法诊断细菌感染的价值，该文就2013年1月—2017年12月临沂市第三人民医院收治的35例经临床确诊的生殖道炎症疾病患者与已知菌7株实施了研究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
将已知菌7株与临沂市第三人民医院接诊的临床确诊为生殖道炎症病变35例患者的标本作为研究对象，患者均为该院收治的阴道炎与宫颈炎患者，年龄20～67岁，均值（45.9±5.4）岁；阴道炎23例、宫颈炎12例。此外，入选对象和（或）家属签署知情同意书愿意配合研究，且该研究经该院医学伦理委员会批准通过。
1.2 方法
1.2.1 菌株类型 共计7株菌株类型，为该市某医院微生物室保存及提供，包括大肠埃希菌（ATCC 25922）、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌及衣氏放线菌。
1.2.2 标本提供 包括人白细胞DNA、白假丝酵母菌DNA及HBV-DNA阳性血清标本，均由上述医院检验科提供。
1.2.3 主要的试剂及相关的仪器 该次研究中涉及的试剂与仪器如下：PCR反应试剂盒、限制性内切酶Hae Ⅲ、HBV DNA提取试剂盒、酶切缓冲液10×M Buffer（2 μL）、酶切位点、毛细管（45×50 μm）、去离子甲酰胺、POP-Polymen、GeneScan 500ROX、琼脂糖、PCR热循环仪、凝胶成像仪、Mupid电泳仪等。
1.2.4 细菌培养 所有患者均采取生殖道标本，以棉拭子從生殖道获取标本，接种在琼脂培养基与巧克力琼脂培养基，以及伊红美蓝琼脂培养基、淋病奈瑟菌培养基中，温度为37℃，时间18～24 h。
1.2.5 荧光标记引物 荧光标记引物采取合成16SrRNA基因序列引物，其中序列情况如下：①上游引物：5’（FAM）-ACACTGGAACTGAGACACGG-3’；②下游引物：5’–CTCTACGCATTTCACCGCTAC-3’。
1.2.6 PCR模板制备 ①标本PCR模板：从宫颈或阴道用拭子取标本1.5 mL放于无菌离心管，加1 mL无菌水，反复振荡混悬后将拭子弃去，以1 500 r/min离心5 min，取0.5 mL上清液，然后继续以15 000 r/min离心10 min，弃去上清液后以无菌水进行洗涤沉淀，反复操作3次，每次离心速率为15 000 r/min、时间为10 min，最终取15 μL沉淀加0.2 mL微量离心管，99℃裂解10 min后浸入冰浴待用。②已知菌PCR模板：收集培养的细菌，用无菌水配制0.5麦氏单位菌悬液，取15 μL加微量离心管后，裂解后置入冰浴待用。
1.2.7 PCR扩增 取dNTP混合物4 μL、10×ExTaq Buffer 5 μL、引物1与引物2各2 μL，以及15 μL模板、0.25 μL的1.25 U TaKaRa Ex Taq及无菌水，控制总体积50 μL，PCR扩增时将反应体系管置入离心机中，以3 000 r/min离心速率处理30 s，置入PCR热循环仪中扩增，反应的条件包括预变性94℃ 1 min、变性98℃ 15 s、退火55℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，共计30周循环，之后置入4℃保存待检。
1.2.8 酶切 取扩增产物2 μL，加入2 μL buffer、1 μL Hae Ⅲ及15 μL无菌水，37℃孵育1 h，置入-20℃冷冻保存。
1.2.9 RFLP分析 将酶切产物1 μL和24 μL去离子甲酰胺与1 μL ROX混匀后，95℃变性2 min，快速冰浴冷却，实施RFLP分析，其中电压15 kV、电流12 μA、温度60℃、功率9.9 mW、时间25 min。
1.3 统计方法
该次研究数据采取SPSS 20.0统计学软件处理，计数资料用[n（%）]表示，采取χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 已知菌PCR及RFLP诊断结果情况
PCR诊断已知菌，其中阳性有大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌6种，而衣氏放线菌为阴性，阳性率为85.71%（6/7），而PFLP诊断为100.00%。
2.2 已知菌PCR扩增产物的PCR与RFLP结果
已知菌的PCR扩增产物酶切片片段长度实验结果与RFLP电子克隆结果基本一致，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨论
生殖道感染属于常见疾病，多为细菌感染所致，在女性中除了会造成盆腔炎与不孕不育等，还可能导致性传播疾病、新生儿先天性疾病等[4-6]，为此尽早明确诊断与处理十分必要。传统诊断方式为分离培养法，被公认为金标准，但耗时长，生长缓慢、无法人工培养及条件苛刻等情况下的标本不宜采用[7-11]，为此需寻求一种准确、快速的诊断方式。
在该次研究中显示PCR诊断已知菌阳性率为85.71%（6/7），生殖道炎症标本阳性率为82.86%（29/35），而PFLP诊断均为100.00%；已知菌的PCR扩增产物酶切片片段长度实验结果与RFLP电子克隆结果基本一致，差异无统计学意义（P>0.05）。该研究结果与同类研究相似，李琳等学者[12]采取16S rRNA集技术对已知菌8株、生殖道炎症标本及其培养物38例进行PCR扩增与限制性内切酶处理，并予以RFLP鉴定不同病原菌，结果显示已知菌扩增阳性率为75%，生殖道感染标本PCR扩增阳性率则为79%，RFLP阳性率均为100%；已知菌株PCR扩增产物5端HaeⅢ完全酶切片段的RFLP结果和电子克隆产物酶切片段基本相同，差异无统计学意义（P>0.05）。PCR与RFLP快速诊断方法能将细菌鉴定到种，测定时间不超过24 h，单份标本能单独测定[13-16]，而且实际操作中不做酶切者当日便可检出结果，需酶切者次日也可获取检测结果，这种方法对象为细菌核酸，和传统细菌培养相比，灵敏度更高，耗时更短，使得假阴性结果更少，在各类细菌感染中均可快速明确诊断[17-20]。
综上所述，相比传统细菌培养法诊断细菌感染，PCR与RFLP方法快速诊断有着快速、灵敏、准确等优势，可以明显缩短诊断时间，可直接鉴定临床标本，值得借鉴。
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（收稿日期：2018-03-15）