材料与方法
1.1供试菌株副溶血性弧菌标准菌株ATCC 33847，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.2主要仪器和试剂2720 Thermal Cycler PCR仪、BIO-RAD Sub-Cell GT 型电泳仪、HIR AYAMA HVE-50高压蒸汽灭菌器、BSC-1000ⅡA2生物安全柜、Gel DocTM XR 170-8170凝胶成像分析系统、Eppendorf Centrifuge 5424高速离心机、HS-800D恒温水浴锅等。
Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000、10×PCR Buffer、细菌基因组DNA提纯试剂盒，均购自上海生工生物工程有限公司。
1.3引物以副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR为靶基因，利用DNAman软件设计引物[14-16]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列见表1。
1.4副溶血性弧菌DNA模板的制备取纯培养菌株接种于3% NaCl碱性蛋白胨水，（37±1）℃培养18 h。吸取表层菌液1 mL放入1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清，無菌双蒸水清洗2次，弃上清，然后用细菌基因组DNA纯化试剂盒提取副溶血性弧菌的基因组DNA。
1.5单一及三重PCR反应体系的建立用gyrase、tdh、toxR这3种基因设计的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC 33847标准菌株的模板DNA进行单一扩增；再用上述3种引物同步对模板DNA进行扩增，通过对PCR各循环参数和各试剂浓度等进行优化，筛选出三重PCR反应的最佳反应条件。
2结果与分析
2.1单重PCR扩增条件的确定以副溶血性弧菌ATCC 33847标准菌株DNA为模板，分别用gyrase、tdh、toxR这3种基因的特异性引物进行扩增，确定了各自PCR的最佳反应条件。
副溶血性弧菌gyrase靶基因PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。25.00 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
副溶血性弧菌tdh靶基因PCR反應条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2500 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
副溶血性弧菌toxR靶基因PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2500 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
gyrase、tdh和toxR 均扩增出清晰条带，大小分别与预期的91、269、368 bp 结果相符（图1）。
2.2三重 PCR 反应条件的确定在单重PCR研究的基础上，对三重PCR反应体系条件进行优化，确定最佳反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。最佳反应体系（25.00 μL）：模板DNA 2.00 μL，10 μmol/L gyrase基因的上下游引物各0.25 μL，10 μmol/L tdh基因的上下游引物各0.50 μL，10 μmol/L toxR基因的上下游引物各0.75 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.50 μL，Taq酶0.50 μL，补充ddH2O至25.00 μL。
在最佳反应条件下，三重PCR扩增的目的条带与预期结果相符（图2）。
3结论
该试验以副溶血性弧菌的保守基因gyrase与特异性致病基因tdh、toxR为靶基因，设计了3对特异性引物，分别进行3种基因单一及三重PCR检测，结果以gyrase、tdh、toxR基因为单一靶基因分别可以扩增出91、269、368 bp条带；同时，通过优化3种靶基因的引物浓度、引物间比例以及退火温度，建立了在1个反应管中同步扩增3种目标基因的三重PCR检测方法。该研究建立的三重PCR检测方法可用于快速检测水产品中的致病性副溶血性弧菌，对提高应对因副溶血性弧菌污染而引起的食品安全事故的响应速度，加强水产品副溶血性弧菌污染状况应急监测具有重要意义。
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