[摘要]目的 探讨天麻超微粉细胞破壁率的测定方法，评价超微粉碎后天麻粉末的细胞破碎程度。方法 采用显微制片细胞计数法，以天麻粉末中的薄壁细胞为评价指标，确定天麻粉末质量与薄壁细胞数目的线性关系，通过对比天麻常规粉末与超微粉薄壁细胞的数量，计算天麻超微粉的细胞破壁率。结果 天麻粉末中薄壁细胞可清晰观察并计数，薄壁细胞数目与粉末的质量成正相关，在3.8124～22.8744 mg范围内线性关系良好，天麻粉末经超微粉碎后细胞已完全破碎，超微粉的细胞破壁率可达99%以上。结论 天麻粉末显微制片细胞计数法测定天麻超微粉细胞破壁率具有可行性和科学性，能够为评价超微粉的细胞破碎程度提供参考和依据。
[关键词]天麻;超微粉碎;薄壁细胞;显微计数;细胞破壁率
[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）7（c）-0020-04
[Abstract] Objective To explore the determining method of cell wall-broken rate of Gastrodia elata micropowde， and to evaluate the degree of cell breakage of Gastrodia elata micropowde. Methods The parenchyma cells in Gastrodia elata powder were taken as the evaluation index， the linear relationship between the quality of Gastrodia elata powder and the number of parenchyma cells was determined by microscopic cell counting method. By comparing the number of parenchyma cells of Gastrodia elata conventional powder with that of ultrafine powder， the cell wall-broken rate of ultrafine powder of Gastrodia elata was calculated. Results The parenchyma cells in Gastrodia elata powder could be clearly observed and counted， the number of parenchyma cells was positively correlated with the quality of Gastrodia elata powder， and the linear relationship was good in the range of 3.8124-22.8744 mg. The cells of Gastrodia elata powder have been completely broken after ultrafine comminution， the wall-broken rate of Gastrodia elata micropowder was over 99%. Conclusion It is feasible and scientific to determine the wall-broken rate of Gastrodia elata micropowder by microscopic cell counting method， and provide reference and basis for evaluating the degree of cell breakage of ultrafine powder.
[Key words] Gastrodia elata; Superfine pulverizing technique; Parenchyma cell; Microscopic count; Cell wall-broken rate
天麻始記载于《神农本草经》中，被列为上品，原名“赤箭”[1]，属兰科多年生草本植物的地下干燥根茎[2]，因茎赤如箭杆而得名，主产于陕西、云南、贵州等地，其主要成分为天麻素、天麻苷元等酚类化合物及甾醇、核苷、有机酸、多糖等[3]，其中天麻素和天麻苷元为天麻中主要的药用活性成分[4]。天麻味甘辛，性平，归肝经，具有息风止痉、平肝阳、祛风通络之功，主治急慢性惊风、抽搐拘挛、破伤风、头痛眩晕、半身不遂、肢体麻木、风湿痹痛等症[5]，临床应用非常广泛。
超微粉碎技术是一门多学科交汇的现代科学技术，应用于较多领域，如材料、化工、医药等行业[6]。中药材超微粉碎技术是在近代工业技术与中医药结合基础上发展起来的“民生科技”，已有研究显示超微粉碎技术在中医药领域中的应用[7]，中药材超微粉碎技术可以使中药材粉末更加细化。目前，我国可供中医入药的植物、动物已多达上万种，其中植物药占绝大比例[8]，由于植物源和动物源药材的有效成分主要分布于细胞内和细胞间质，尤以细胞内为主，因此，如何最大限度释放药材活性成分涉及到破坏细胞壁的问题[9]。超微粉碎技术可达到细胞破碎的目的，使活性成分暴露在细胞外，从而更加容易被溶剂提取或被人体吸收，提高药材的生物利用度。
不同中药具有不同的显微特征，细胞破壁率的测定方法也不同，天麻的显微特征包括薄壁细胞、厚壁细胞、草酸钙针晶、糊化多糖、导管等，其中薄壁细胞是天麻的主要组织细胞[10]，呈类多角形或长多角形，显微镜下易于观察，且内部含有糊化多糖颗粒，适合作为检测指标进行细胞破壁率的测定。目前还没有关于天麻超微粉细胞破壁率测定文献的报道，本研究采用显微计数法测定天麻超微粉的细胞破壁率，旨在为后续天麻超微饮片的质量控制提供参考和依据。
1材料、仪器及试剂
1.1药材
收集于西藏林芝波密县，经广州白云山汉方现代药业有限公司按照2015版中国药典检测合格[2]。
1.2仪器
DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机（江阴市新安粉体设备有限公司）;BFM6型“贝利”振动式微粉机（济南贝利粉技术工程有限公司）;XSP-35TV-1600X型灵峰光学显微镜（上饶灵峰光学仪器厂）;BT-2001型激光粒度分布仪（丹东百特仪器有限公司）。
1.3试剂
醋酸;甘油（广州化学试剂厂）;水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）。
2方法与结果
2.1样品制备
2.1.1粗粉制备 天麻药材500 g干燥至水分10%左右，粉碎成粗粉（30目），备用。
2.1.2超微粉制备 取30目粗粉转移至贝利振动式微粉机中进行超微粉碎20 min，得天麻超微粉，采用激光粒度分析仪检测粒度，超微粉粒度分布D90为40.61 μm，备用。
2.2天麻粗粉细胞计数[11]
2.2.1天麻粉末及切片显微制片 精密称取天麻粗粉（30目）3.1770 g，置于25 ml容量瓶中，粉末经稀盐酸浸泡除去白色乳浊液后用蒸馏水洗涤，然后加入水合氯醛溶液定容至刻度，超声处理5 min，使粉末均匀分散;将容量瓶置90℃水浴锅中加热10 min左右，使天麻粗粉透化完全，然后用移液枪吸取6份，分别为30 μl（相当于3.8124 mg粉末）、60 μl（相当于7.6248 mg粉末）、90 μl（相当于11.4372 mg粉末）、120 μl（相当于15.2496 mg粉末）、150 μl（相当于19.062 mg粉末）、180 μl（相当于22.8744 mg粉末），将其分别滴在载玻片上，将载玻片放在水浴锅表面加热，挥干溶剂后滴加醋酸甘油水，用盖玻片压平装片（装片时防止气泡产生，使混悬液布满整个盖玻片，以不溢出为度），分别置于显微镜下观察。天麻药材水中浸泡5 h后用美工刀切取薄片，置载玻片上滴加水合氯醛溶液1～2滴，置酒精灯火焰上来回移动加热，重复3次，用滤纸吸干残余水合氯醛溶液，滴加醋酸甘油水溶液，用蓋玻片压平装片，置显微镜下观察。
2.2.2天麻薄壁细胞计数 从“2.1”下的天麻粗粉显微特征图（图1）可以看出，天麻中最主要的细胞为薄壁细胞，薄壁细胞中含有大量的糊化多糖颗粒，另外还存在少量的厚壁细胞。“2.1”下的天麻超微粉（图2）中除糊化多糖外，其他组织基本破碎，因此，选择天麻中的主要细胞即薄壁细胞为特征性细胞进行计数。以1个视野为1个计数单位，观察30、60、90、120、150、180 μl六个体积的天麻粗粉混悬液所制得载玻片中完整的薄壁细胞数目，每个载玻片取8个计数单位的平均值，具体见图3，对应的细胞个数分别为16.875、26.125、31.125、36.875、38.500、40.000。
A.低倍镜下天麻横切面（100×）;B.高倍镜下天麻粗粉中观察到的薄壁细胞（400×）;C.高倍镜下天麻粗粉中观察到的厚壁细胞（400×）
A.天麻超微粉在低倍镜下的整体特征（100×）;B.天麻超微粉在高倍镜下观察到的糊化多糖颗粒（400×）
2.3细胞数目与粉末质量相关标准曲线制定
以粗粉的称样量（X）为横坐标，每个计数单位中薄壁细胞的个数（Y）为纵坐标，建立标准曲线，得线性回归方程Y=1.1879X+15.733，r=0.9556，提示天麻粗粉中薄壁细胞个数在3.8124～22.8744 mg范围内线性关系良好，可作为显微特征计数指标（图4）。
2.4天麻粗粉细胞计数方法学考察
2.4.1精密度考察 精密称取3.0038 g天麻粗粉，同“2.2.1”方法制片6份，分别观察8个视野，相对标准偏差（RSD）为3.11%，提示本方法精密度良好。
2.4.2稳定性考察 取“2.4.1”下样品，室温放置，分别于0、3、6、9、12 h在显微镜下观察，RSD为7.45%，提示样品混悬液在12 h内稳定。
2.4.3重复性考察 取6份相同质量的同一批天麻粗粉，相同方法制片，于显微镜下观察，薄壁细胞个数RSD为6.24%，提示本方法重复性良好。
2.5天麻超微粉破壁率测定
精密称取天麻超微粉3.0175 g，加水合氯醛溶液定容，取60、90、120 μl混悬液，分别置于载玻片上，按照“2.2.1”的方法制片，于显微镜下观察（图2），分别观察8个视野，计数3个体积混悬液中完整薄壁细胞的个数，然后根据线性回归方程式Y=1.1879X+15.733计算3个体积混悬液对应天麻粗粉质量中薄壁细胞的个数;最后，根据天麻粗粉薄壁细胞数和超微粉薄壁细胞数目，按以下公式计算破壁率[12]：Y=（A-B）/A×100%，其中“Y”表示薄壁细胞破壁率，“A”表示天麻粗粉薄壁细胞个数;“B”表示天麻超微粉薄壁细胞个数，“W”表示天麻混悬液中粉末的质量，各项指标见表1。结果显示，超微粉碎技术可以使天麻饮片的破壁率达到100%，以天麻薄壁细胞为计数指标，具有科学性、可行性。
3讨论
由于超微粉碎技术的发展，中药超微饮片随之而诞生，其中天麻超微饮片已上市销售。超微粉的制备是生产破壁饮片的重要环节，而细胞破壁率是评价超微粉质量的关键指标。目前，已有学者对丹参[13]、苦瓜[14]和铁皮石斛[15-16]等植物的超微粉细胞破壁率测定进行了研究，参考以上几种药材细胞破壁率的测定方法，本文探讨了天麻超微粉细胞破壁率的测定，旨在为评价超微粉的细胞破碎程度提供参考和依据。
天麻主要含薄壁细胞，并且薄壁细胞中可见大量的糊化多糖颗粒，可推测有效成分天麻素和天麻多糖主要存在于薄壁细胞中，因此，以薄壁细胞为超微粉碎指标性特征细胞，并以薄壁细胞的破壁率作为超微粉碎的评价指标具有科学性。
本实验通过对比不同目数的天麻粗粉，发现30目的粗粉细胞完整度较高，且薄壁细胞成片存在，易于计数，但30目粗粉因颗粒较大，在制片时易产生气泡，因此，需要在使用水合氯醛溶液透化前用适当稀盐酸溶液处理，除去干扰显微观察的白色乳浊样物质，并使颗粒软化后易于挤压制片，这是本实验的一大发现。
本实验首次对天麻超微粉进行破壁率测定，测定细胞破壁率的关键在于回归方程的精确性和细胞计数的准确性，由于天麻中除了薄壁细胞外还含有少量的厚壁细胞，因此，在细胞计数前需充分透化天麻粉末，使显微观察时能更好地区分薄壁细胞和厚壁细胞。天麻粉末显微制片透化方法后续还需广大学者继续改进，使天麻超微粉的破壁率测定更加精确，为天麻超微饮片的质量控制研究提供参考和依据。
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（收稿日期：2018-12-18 本文编辑：祁海文）