hqɚr))ev=yiY۲]gn4]-t0O]4Ф9Muvi6ۏ|?w)uY۲"https://www.dg9.com.cn/k/duizhao/" target="_blank" class="keylink">对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品适量，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容至刻度，振荡摇匀，配成0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。
1.3.2 样品溶液制备 取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，加70%乙醇20 mL称定重量，超声提取1.0 h，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取过滤液1 mL置于25 mL容量瓶中，即得样品溶液。
1.3.3 标准曲线的制定 精密称取120 ℃干燥恒重的芦丁对照品5 mg，加70%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，制成浓度为0.2 mg/mL的标准品溶液。分别取标准品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加4%氢氧化钠4.0 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，然后在波长508 nm处测定吸光度。得到直线方程为y=11.164x-0.011 3，R2=0.999 1，在0.01～0.08 mg/mL范围内，浓度与吸光度有良好的线性关系，芦丁标准曲线见图1。
1.3.4 方法学考察
1）精密度试验。精密称取广西那坡县产的罗汉松药材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于波长508 nm处连续测定6次吸光度，结果RSD为1.63%，该方法精密度良好。
2）重复性试验。精密称取广西那坡县产的罗汉松药材样品6份，每份药材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于波长508 nm处平行测定其吸光度，计算药材的平均含量为23.16 mg/g，RSD为2.26%，表明该方法重复性良好。
3）稳定性试验。精密称取广西那坡县产的罗汉松药材粉末1.0 g，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于508 nm波长处分别在0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，计算药材的RSD为2.08%，结果表明，吸收度在60 min内基本不变，可见样品在60 min内稳定。
4）加样回收率试验。称取罗汉松药材粉末6份，每份0.5 g，精密称定，加入芦丁对照品11.58 mg，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。于波长508 nm处平行测定其吸光度，计算总黄酮的含量。平均回收率为98.96%，RSD为2.65%（n=6），该方法回收率良好。
1.4 单因素试验
1.4.1 提取方法选择 取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h、20 mL 70%乙醇为提取条件，分别采用回流提取法、超声提取法和溶剂浸渍法对药材总黄酮进行提取，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定。结果显示，超声提取与回流提取的提取率都比溶剂浸渍法的提取率高，且超声提取与回流提取的提取率基本无差异，考虑到操作方便与节能，选择超声提取方法。
1.4.2 乙醇溶剂体积分数选择 取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h、20 mL不同体积分数乙醇溶剂为提取条件，设计乙醇体积分数分别为30%、50%、60%、70%、80%和95%，采用超声提取法测定药材总黄酮得率。
1.4.3 乙醇溶剂提取体积选择 取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h、70%乙醇为提取条件，采用超声提取法，取不同体积70%乙醇10、20、30、40、50、60 mL进行单因素试验，测定药材总黄酮得率。
1.4.4 提取时间选择 取药材粉末1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，以70%乙醇30 mL为提取条件，采用超声提取法，以提取时间对药材总黄酮得率进行单因素试验，设提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，测定药材总黄酮得率。
1.5 正交试验
从罗汉松茎中提取总黄酮的方法主要包括有机溶剂提取法、浸渍法[16，17]。参考《中国药典》2015年版相关方法，选择乙醇为溶剂的提取方法，考察了乙醇体积分数（60%、70%、80%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40）（质量∶体积，下同）、提取时间（1.0、1.5、2.0 h）3个条件，选用L9（34）正交试验设计（表2）。
精密称取罗汉松药材粉末1.0 g，精密称定，按照上述罗汉松茎中总黄酮的提取方法进行提取，再按L9（34）正交试验方案，使用紫外-可见分光光度计对罗汉松茎中总黄酮含量进行测定。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
不同乙醇溶剂体积分数单因素试验结果显示，采用70%乙醇超声提取，罗汉松茎中总黄酮得率为2.19%，含量最高，达到21.94 mg/g;不同乙醇溶剂提取体积单因素试验结果表明，当乙醇溶液提取体积为30 mL时罗汉松茎中总黄酮得率2.35%，含量最高，达到23.53 mg/g;不同提取时间单因素试验结果表明，提取时间为1.0 h时，罗汉松茎中总黄酮得率为2.17%，含量最高，达到21.66 mg/g。
2.2 正交试验结果
根据正交设计，试验方差分析结果可知，以罗汉松茎中总黄酮含量为试验指标，各试验因素对罗汉松总黄酮提取效果的影响程度不同。直观分析结果（表3）表明，乙醇体积分数和料液比对总黄酮的提取工艺有明显影响，其次是提取时间;方差分析结果（表4）表明，乙醇体积分数和料液比对罗汉松茎中总黄酮提取有显著影响，而提取时间无显著影响，且各因素影响的强弱为A>B>C，考虑试验效率和时间，选择提取时间为1.0 h，因此最理想的提取方案是A2B1C1，即乙醇体积分数70%，料液比1∶20，超声提取时间1.0 h，此时提取效果最佳。
2.3 样品含量测定
精密称取罗汉松药材茎部粉末3份，每份1.0 g，置于锥形瓶中，按“1.3.2”操作步骤制备供试品，按标准曲线的制定方法进行显色测定，使用紫外-可见分光光度计测定其总黄酮含量，结果见表5。结果表明，广西合浦县、南宁市产的罗汉松总黄酮含量较高，分别达到25.57、24.18 mg/g，是较好的用于提取总黄酮的药材。
3 讨论
以中药罗汉松茎为研究对象，考察了乙醇体积分数、料液比和提取时间3个影响因素，采用超声提取法来提取罗汉松茎中总黄酮，利用L9（34）正交试验的方法来优选出罗汉松茎中总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，超声法提取罗汉松茎中总黄酮的最佳工艺为乙醇体积分数70%，料液比1∶20，提取时间1.0 h，此提取效果最佳，为优化超声法提取罗汉松茎中总黄酮的工艺提供了参考依据。
在相同试验条件下，加入等量同体积分数的乙醇可能会出现提取效率不一致的状况。具体原因可能是罗汉松的茎接触乙醇溶剂的面积不一样。但是在加入相同质量的罗汉松茎的情况下，加入乙醇的量越多，对提取的效率有正向影响。除此之外，还可以考察更多的试验因素，如提取温度、溶剂pH和提取次数等，并且每个因素也可以通过单因素考察法确定出试验水平范围，再通过正交设计试验优选出提取工艺。
用超声法提取罗汉松茎中的总黄酮，适宜的超声提取条件可以提高总黄酮的得率。由于超声波的空化作用、机械作用和热效应等共同的作用下，罗汉松茎中总黄酮的溶出速度加快，提高了提取效率。
广西不同产地罗汉松茎中总黄酮含量差异较大，广西合浦县的罗汉松茎中总黄酮含量最高，其次是广西南宁市，而广西全州县和广西百色市的罗汉松茎中总黄酮含量较低。罗汉松自然资源丰富，在临床应用中广泛使用，對罗汉松茎中有效成分的开发有待加强。
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