[摘要] 为建立一种能同时鉴别人参、三七、西洋参及其掺杂品的方法。通过分析人参属ITS，18S和matK序列，寻找特异性SNP位点设计引物，建立多重位点特异性PCR法，并对不同来源的人参、三七、西洋参样品进行扩增，根据特异性条带大小进行鉴别。在退火温度为60 ℃，循环数为35时，人参、三七和西洋参分别出现约250，500，1000 bp的特异性条带。该方法对于人参、三七、西洋参相互掺杂的混合样品，人参中掺杂三七或西洋参以及三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5%，对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5%，掺杂三七的检出限为1%。表明建立的多重位点特异性PCR可用于人参、西洋参、三七的掺杂鉴定。
[关键词] 人参； 西洋参； 三七； 多重位点特异性PCR； 掺伪； 分子鉴定
Identification of Panax ginseng， P. notoginseng and P. quinquefolius
admixture by multiplex allelespecific polymerase chain reaction
JIANG Chao， LUO Yuqing， YUAN Yuan*， HUANG Luqi， JIN Yan， ZHAO Yuyang
（State Key Laboratory of Daodi Herbs Breeding Base， National Resource Center for Chinese
Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Abstract] To achieve a molecular method to identify Panax ginseng， P. notoginseng，P. quinquefolius and their admixture. The ITS，18S and matK sequences of Panax genus were analyzed to develop speciesspecific SNP marker. Three pairs of speciesspecific primers were designed to establish a multiplex allelespecific polymerase chain reaction （MASPCR） and the samples from different regionwere tested. The results showed that when the annealing temperature was 60 ℃ and the cycle number was 35， approximately 250， 500，1 000 bp specific band were obtained from P. ginseng， P. notoginseng and P. quinquefolius obtain， respectively. This method could also be used to authentificate admixture samples and could detect 0.5% percent of P. notoginseng or P. quinquefolius adulterated in P. ginseng， or 0.5% percent of P. ginseng or P. quinquefolius adulterated in P. notoginseng. The detect limit of P. ginseng in P. quinquefolius was 0.5% and P. notoginseng in P. quinquefolius was 1%. This results showed that the present method could be used as a promise method to identify Panax ginseng， P. notoginseng， P. quinquefoliusand their admixture.
[Key words] Panax ginseng； Panax notoginseng； Panax quinquefolius； multiplex allelespecific polymerase chain reaction； admixture； molecular identification
人參、西洋参、三七是我国常用名贵中药，其根、根茎、叶、花、果实等均做药用，价值很高。在中医临床用药上，人参性温，功效大补元气、固脱生津、安神；三七性温，功效散瘀止血、消肿定痛；西洋参性凉，功效补气养阴、清热生津，三者药效具有很大区别，不能混用。然而，由于人参、三七、西洋参为人参属近缘物种，形态和化学成分相似，市场时有掺杂混用现象发生，人参、西洋参饮片或人参花、西洋参花、三七花相互掺杂尤为常见，对用药安全造成损害，需要建立准确、可靠、特别是能同时检测是否存在相互掺杂的鉴定方法。
分子鉴定尤其是基于SNP的方法，因其具有准确性高、特异性好、不受环境影响等优点，在人参属物种鉴定中已有应用，如聚合酶链式反应单链构象多态性（PCRSSCP）[1]、聚合酶链式反应限制性内切酶酶切图谱多态性（PCRRFLP）[2]、位点特异性PCR或多重PCR[36]以及序列测定技术[6]等。但这些技术只关注人参属真伪品的鉴定，无法鉴定是否存在掺杂品，对市场实际存在的花、叶、饮片类掺杂样品需要进行多次PCR反应才能判定。本研究通过建立多重位点特异性PCR方法鉴别人参、三七和西洋参，只通过1次PCR反应即可准确地对三者及其相互掺伪进行鉴别，并对反应条件进行优化，力求建立准确稳定的人参属掺杂样品检测方法。
1 材料与方法
1.1 植物
人参原植物（包括根和叶）采自东北不同产区以及北京市怀柔区，由中国农业科学院特产所许世权研究员鉴定，三七原植物采自云南文山州不同产区，由昆明理工大学崔秀明教授鉴定，西洋参原植物采自河北、吉林和北京，竹节参、珠子参和羽叶三七原植物采自安徽、湖北和云南，由湖北轻工大学陈平教授鉴定。人参、西洋参、三七、竹节参、珠子参花、种子及药材样品采自亳州药材市场，由安徽中医药大学周建理教授和中国中医科学院中药资源中心金艳助理研究员鉴定。所有样品经减压干燥后保存于中国中医科学院中药资源中心，样品详细信息见表1。
1.2 鉴别标记获得与引物设计
此前的研究已发现人参和西洋参的特异性SNP位点[4]，本研究参考此位点使用Primer Premier 5.0设计出人参、西洋參的特异性鉴别引物。为寻找三七鉴别位点，从NCBI数据库中下载人参属物种ITS，rbcL，matK，18S rRNA序列，利用BioEdit软件进行同源对齐，校对后分析其特异性SNP位点，发现三七花ITS序列（以JQ764993.1为参照）第57，68，70，522位均存在特异性SNP位点，分别为T，T，G，T，而其他人参属所有物种包括人参均为C，C，A，A，以此为基础利用Primer Premier 5.0软件设计三七花特异性鉴别引物，使正反向引物3′端位均于SNP位点上，调整退火温度在50～55 ℃，并分析所设计的人参、西洋参、三七引物间发夹结构、引物二聚体或错误引发情况。设计的特异性鉴别引物序列见表2，由生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.3 DNA提取
取1 g植物材料，使用球磨粉碎机粉碎至能过5号筛。取粉末20 mg，使用碱裂解法[7]提取总DNA，使用Nanodrop 2000测定DNA浓度，调整浓度至30 mg·L-1，用于PCR扩增或于-20 ℃下保存。
1.4 PCR扩增及电泳
多重位点特异性PCR鉴别反应在200 μL的PCR管中进行，25 μL PCR反应体系包括 10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs混合液（10 mmol·L-1）1.5 μL，人参上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，三七上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，西洋参上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.4 μL，DNA模板（10～50 ng） 1 μL，双蒸灭菌水 19.1 μL，反应液振荡混匀，瞬时离心后置PCR仪上进行扩增。程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共35个循环；最后72 ℃再延伸3 min。PCR产物加入Loading buffer后经EB预染的1.2%的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪观察结果。
2 结果与分析
2.1 多重位点特异性PCR条件的确定
2.1.1 退火温度与循环数 前期预实验结果发现使用对应的特异性鉴别引物进行扩增，人参、三七、西洋参在58～62 ℃时分别能扩出约250，500，1 000 bp大小的条带，以此为基础进行多重位点特异性PCR鉴别，并对影响多重PCR特异性、准确性的关键因素退火温度和循环数进行考察。结果表明退火温度为60～62 ℃时人参、三七、西洋西洋参分别出现约250，500，1 000 bp大小的特异性条带，无非特异性扩增及假阳性条带出现，但61 ℃以上时人参、三七特异性条带亮度明显降低，确定多重PCR退火温度为60 ℃，见图1A。对循环数进行考察，31～37个循环时时人参、西洋参、三七均能获得正确的鉴别结果，35个循环及37个循环PCR条带亮度大于31，33个循环，见图1B。考虑到根、叶、花、种子DNA提取质量与浓度可能存在区别，药材经加工后DNA存在降解出现假阴性结果的风险，选择PCR循环数为35个循环，对新鲜植物材料的鉴别，可减少循环数至31个。
2.1.2 最适引物量的确定 PCR引物用量及引物间的相互比例对多重特异性PCR结果有重要影响。根据预实验结果，以西洋参、三七引物量均为0.2 μL为基础，分别考察人参上下游引物用量为0.1，0.2，0.3，0.4 μL时对多重特异性鉴别结果的影响，结果0.1 μL时人参无条带，0.3，0.4 μL时人参条带明显，且无假阳性条带出现，确定人参上下游引物量为0.3 μL；在此基础上考察三七用量分别为 0.1，0.2，0.3，0.4 μL的影响，结果 0.1 μL 时三七条带暗淡，0.2 μL引物时三七电泳条带亮度大且无假阳性条带出现。在此基础上同法西洋参用量为0.15，0.2，0.25，0.3 μL，结果0.25 μL引物时条带亮度大，最终确定引物配比为人参引物量三七引物量西洋参引物量0.3 μL∶0.2 μL∶0.25 μL。
2.1.3 Taq酶与PCR仪 使用建好的方法在不同的Taq酶和不同PCR仪上进行多重位点特异性PCR以考察方法的适用性。结果表明，使用低保真的rTaq（Takara公司）、Fast Taq聚合酶（TransGen公司）、中度保真的Ex Taq（Takara公司）酶均获得正确的鉴别结果，而高保真性的的PrimeSTAR HS Taq进行鉴定时人参、三七、西洋参样品均出现假阳性条带，见图1C。这可能是由于高保真Taq DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，导致位于3′端的鉴别位点被酶切，剩下序列完全匹配获得扩增导致的，表现出与常规位点特异性PCR一致的特性[8]。使用不同的PCR仪，除老式的PCT100型PCR仪外，其他PCR仪均获得正确的鉴别结果，见图1D，由于多重PCR对退火温度敏感，不同PCR仪温控水平有差异，在进行鉴定时应进行温度调校。
2.2 准确性考察
使用建好的方法对来自全国主产区的140批人参、79批三七、44批西洋参及40批人参属其他物种样品进行多重位点特异性PCR扩增，结果人参原植物、药材、花、种子等均扩增获得250 bp的特异性条带，三七原植物、药材、三七花均获得约500 bp的特异性条带，西洋参获得约1 000 bp的特异性条带，人参属其他物种包括竹节参、珠子参、羽叶三七均无条带，无假阳性和假阴性结果出现。部分结果见图2。
2.3 掺伪检出限
为检测多重位点特异性PCR对掺伪样品鉴别能力。取西洋参和三七粉末各0.5g等量混匀，取不同量混合物与人参粉末充分混匀，获得人参粉末中掺有50%，20%，10%，5%，2%，1%西洋参三七混合物的系列混合粉末，使用上述方法提取DNA并进行多重特异性PCR鉴定，以检测方法对人参中掺杂西洋参、三七的检出限；以同样的方法制作人参、西洋参混合物和三七、西洋参混合物，并制作相应系列混合粉末，以检测三七中掺杂西洋参、人参的检出限和西洋参中掺杂人参、三七的检出限。
结果表明人参中掺杂0.5%以上的三七或西洋参可检出见图3（泳道7），同理其对西洋参三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5%（泳道15），对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5%（泳道23），掺杂三七的检出限为1%（泳道22）。
4 讨论
真伪掺杂品的鉴别一直是中药鉴别的难点问题，依赖于具有同时检测真伪品特异性标记的方法的开发。多重PCR是一种在同一体系内进行多个PCR扩增的技术，其突出优势是在一次检测中同时表征多个位点或基因片段，从而具有掺杂检测的潜力。此前的人参属多重PCR鉴别方法往往只关注于能否同时检测人参、西洋参、三七物种，对每种药材均需要2对引物的扩增结果才能判定，无法用于鉴定是否存在掺杂样品。如刘丽等[3]的多重PCR鉴别体系结果的判定，只存在150 bp条带的为人参、只存在400 bp条带为三七，同时存在150，400 bp条带为西洋参，其结果无法区分西洋参与人参三七混合样品，也无法区分西洋参与人参西洋参混合样品。鉴于此，本文针对人参、西洋参、三七分别设计了位点特异性鉴别引物，对每种药材使用单一引物对进行鉴别，从而能检测掺杂样品，做到对中药真伪的准确控制。
人参、西洋参、三七为近缘物种，遗传物质相似，DNA序列一般只存在少数的SNP位点，专属性标记开发困难。本研究通过对人参属所有物种的18S，ITS，matK序列进行分析，分别发现3组SNP位点，可特异性鉴别人参、西洋参、三七。由于只存在单核苷酸的变异，引物间相互作用、PCR反应体系、循环参数等均直接影响特异性PCR鉴别的准确性和特异性[910]。本研究对影响PCR特异性的关键因素退火温度、循环数、Taq酶种类和引物用量进行了考察，发现本研究建立的方法对条件要求较为宽松，但Taq酶种类对其特异性具有较显著的影响，仅不具有3′5′外切酶活性的Taq酶能准确鉴别人参、西洋参、三七。为考察多重位点特异性PCR方法的准确性，本研究对共计超过300 批人参、西洋参、三七及其他近缘物种进行了实验验证，包含根、叶、花、种子和不同类型的药材，结果所有人参、三七、西洋参均获得正确的阳性鉴别结果，其他人参属近缘物种均为阴性，与形态学鉴定结果完全吻合，进一步验证了该方法的可靠性和稳定性。为检测该方法对混伪品的鉴别能力，本研究制作了一系列不同掺伪程度的人参、西洋参、三七混合样品并进行多重位点特异性PCR扩增，结果对人参、西洋参、三七中任意两者相互掺伪的检出限均达到1%，可满足中药产业链尤其是不同形态产品的生产检验的需求。传统对人参和三七通过性状进行鉴别，对人参粉和三七粉基于草酸钙簇晶的显著差异进行显微鉴别，对种子种苗、果实、茎叶、花等其他药用部位则需要另外建立专用的鉴别方法，基于DNA的多重PCR鉴别方法可同时对人参、三七、西洋参的不同生长部位、发育阶段与加工形式的产品进行掺杂鉴别，是对传统鉴别方法的补充和创新。
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[责任编辑 吕冬梅]