对照品薄荷醇（110728-200506）、阿魏酸（110773-201012）、蒙花苷（111528-200606）、迷迭香酸（111871-201203）购自中国食品药品检定研究院；薄荷酮（111705-201105）、绿原酸（110753-201415）、咖啡酸（110885-200102）、香叶木素-7-O-葡萄糖苷（140820）、香蜂草苷（140620）、香叶木素（111788-200801）购自南京春秋生物工程有限公司；水杨酸甲酯（29412）购自阿拉丁试剂公司；橙皮苷（140107）购自上海融禾医药科技有限公司。以上对照品纯度大于98%。甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），甲酸（色谱纯，德国Merck公司），超纯水（实验室自制），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 干燥加工方法
取薄荷新鲜药材，去除杂质，切成10～15 cm的带叶茎枝，混合均匀，分别取约1 kg，干燥加工方法见表1。干燥前取少量鲜样，测定其初始含水率，干燥过程观察、称重并计算实时含水率，含水率达10%时停止干燥。
2.2 单萜类化学成分的测定方法
2.2.1 GC-MS色谱及质谱条件 Agilent HP-5MS石英毛细管色谱柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），载气He，分流比20∶1，流速1.0 mL·min-1，程序升温（初始50 ℃，维持4.0 min，2 ℃·min-1升至120 ℃，维持3.0 min，2.5 ℃·min-1升至220 ℃，维持1.0 min， 20 ℃·min-1升至280 ℃，维持4.5 min），进样口温度200 ℃。MS离子源EI，离子源温度230 ℃，色谱质谱接口温度250 ℃，电子能量70 eV，电子倍增器电压1 800 V，扫描方式SCAN，扫描范围m/z 30～300；进样量2 μL。优化后的色谱图见图1。
2.2.2 对照品溶液的制备及线性关系考察 取薄荷酮、薄荷醇对照品适量，精密称定，以无水乙醇溶解，配成148.0，1 044 mg·L-1的混合对照品溶液A；取水杨酸甲酯对照品适量，精密称定，以无水乙醇溶解，配成431.0 mg·L-1的内标溶液。以上溶液均保存于4 ℃冰箱，备用。分别精密吸取混合对照品溶液A 0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL于10 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀。取以上各系列浓度混合对照品溶液1.0 mL，加内标溶液110 μL，充分混匀，以薄荷酮、薄荷醇与内标的峰面积之比为Y，薄荷酮、薄荷醇浓度为X，考察线性关系，见表2。
2.2.3 供试品溶液的制备 取薄荷干燥品，粉碎，过筛（40目），取粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加内标溶液100 μL，加10 mL无水乙醚，摇匀，浸泡2 h，取上清液，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 精密度试验 取2.2.2项下制备的混合对照品溶液1份，按2.2.1项下色谱质谱条件进样测定，连续进样6次，各待测成分峰面积与内标物峰面积比值的RSD均小于2.5%，表明仪器精密度良好。
2.2.5 重复性及稳定性试验 取25号样品粉末约1 g，6份，精密称定，分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱质谱条件进样测定，各成分含量的RSD均小于2.2%，表明该方法的重复性良好。取上述供试品溶液1份，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定，各待测成分峰面积与内标物峰面积比值的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.6 加样回收试验 取已知含量的25号样品粉末约0.5 g，9份，精密称定，根据样品中成分含量的80%，100%，120%，分别加入相应对照品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱质谱条件进样测定，计算回收率。结果薄荷酮、薄荷醇平均回收率分别为98.80%，99.37%，RSD均小于2.1%。
2.3 酚酸类、黄酮类化学成分的测定方法
2.3.1 UPLC-TQ-MS色谱及质谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温35 ℃；流动相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；流速0.4 mL·min-1；梯度洗脱（0.0～1.0 min，15.0%B；1.0～1.2 min，15.0%～20.0%B；1.2～3.0 min，20.0%B；3.0～5.0 min，20.0%～95.0%B；5.0～6.5 min，95.0%B；6.5～6.6 min，15.0%B；运行时间7.5 min）。离子化模式ESI+；多反应监测（MRM）方式；离子源温度150 ℃；毛细管电压3.0 kV；脱溶剂气温度550 ℃；脱溶剂气流量1 000 L·h-1；碰撞气流量0.15 mL·min-1。进样体积2 μL，优化后的色谱图见图2，各对照品色谱、质谱参数见表3。
2.3.2 对照品溶液的制备及线性关系考察 取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木素-7-O-葡糖糖苷、蒙花苷、香蜂草苷、香叶木素对照品适量，精密称定，以甲醇溶解，配成质量浓度分别为47.6，46.1，56.8，54.4，55.0，49.5，44.8，42.4，47.2 mg·L-1的混合对照品溶液B。精密吸取上述混合对照品溶液B适量，稀释成系列不同浓度混合对照品溶液，以各对照品峰面积为Y，浓度为X，考察线性关系，见表2。
2.3.3 供试品溶液的制备 取粉碎过40目筛的样品粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称重，静置20 min，超声（100 Hz，25 ℃）30 min，称重后补足失重，取上清液，离心（13 000 r·min-1）10 min，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 精密度试验 取2.3.2项下制备的混合对照品溶液1份，按2.3.1项下色谱质谱条件进样测定，连续进样6次，各待测成分峰面积的RSD均小于2.5%，表明仪器精密度良好。
2.3.5 重复性及稳定性试验 取25号样品粉末约1 g，6份，精密称定，分别按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱质谱条件进样测定，各成分含量的RSD均小于2.7%，表明该方法的重复性良好。取上述供试品溶液1份，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定，各待测成分峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.6 加样回收试验 取已知含量的25号样品粉末约0.5 g，9份，精密称定，根据样品中成分含量的80%，100%，120%，分别加入相应对照品，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱质谱条件进样测定，计算回收率。结果绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷、迷迭香酸、香叶木素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、香蜂草苷、香叶木素平均回收率分别为99.67%，97.69%，97.45%，100.6%，98.66%，103.4%，100.1%，103.2%，100.8%，RSD均小于2.0%。
2.4 样品测定
取经不同干燥方法处理的样品适量，分别按2.2.3，2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1，2.3.1项下色谱质谱条件进样测定，记录各待测成分的峰面积。单萜类成分薄荷酮、薄荷醇以其峰面积与内标水杨酸甲酯的峰面积之比按外标法计算供试品中各成分的量；酚酸类及黄酮类成分按外标法计算供试品中各成分的量。每个样品平行3次进样测定，以均值作为测定结果，见表4。
结果显示，11种指标成分中，以薄荷醇、咖啡酸、迷迭香酸含量变化最为显著，最低者分别为0.128 4，0.024 0，0.114 5 mg·g-1，最高者可分别达10.92，1.908，15.26 mg·g-1，相差80倍以上；其次以绿原酸、香叶木素-7-O-葡萄糖苷含量变化较大，含量最低者与最高者相差20倍以上；其余各成分含量变化较小。可见，干燥方法对薄荷醇、咖啡酸、迷迭香酸、绿原酸及香叶木素-7-O-葡萄糖苷影响较大。
值得注意的是，微波干燥法以及微波杀青预处理方式的薄荷醇含量显著低于传统晒干、阴干法和现代红外、热风干燥法，这与薄荷醇的挥发性以及微波干燥水分子剧烈运动加剧其挥发程度有关；此外，香叶木素-7-O-葡萄糖苷在微波、红外、热风干燥法不同温度下的含量变化规律略有差异，分别在70，50，60 ℃下达到最高，与传统阴干法含量接近甚至略高，而微波杀青预处理对其影响也不尽一致，变化规律有待进一步研究。
2.5 适宜干燥方法的确定
采用DPS数据处理系统，以35批次样品中11种指标性成分含量组成35×11矩阵，对样品测定结果进行逼近理想值排序法（TOPSIS）分析[15]，结果见表5。
TOPSIS评价结果显示，前6种由优至劣顺次排序的方案为：热风变温45～60 ℃、热风变温45～50 ℃、杀青60 s-红外50 ℃、晒干转阴干、阴干、晒干，提示热风变温先低温（45 ℃）干燥，后高温（60 ℃）干燥能够较大程度地保留单萜类、酚酸类、黄酮类成分；微波高温（100 ℃）杀青联合其他干燥技术在酚酸类、黄酮类成分的保留上也具有较理想的效果，但其挥发性单萜类化学成分含量较低；传统晒干、阴干等薄荷药材干燥方法具有一定的合理性。另一方面，热风变温干燥样品的外观为绿至灰绿色，色泽鲜艳，质地脆，香气浓，而微波杀青联合干燥样品外观灰绿至褐色，色泽较暗，香气不足，其原因可能为微波杀青温度高，鲜样失水快导致局部温度过高，容易褐变甚至碳化。因此，综合考虑薄荷药材干燥加工过程中活性成分含量及外观性状等因素，热风变温干燥（先低温45 ℃干燥，后升温60 ℃干燥）为薄荷药材较为适宜的现代干燥加工方法。
3 讨论
研究表明[16-17]，酚类物质（包括酚酸类、黄酮类）在植物体的生物合成和代谢受苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的调控，分别负责酚类化合物的合成与代谢，其中绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸等含邻二酚羟基结构的化学成分最易受PPO酶的影响而氧化成醌类物质。本研究结果显示，酚酸类化学成分变异程度大、变化范围宽，推测可能为干燥过程中PPO酶活性发生变化，导致此类成分含量的显著改变。本文研究结果微波100 ℃杀青后，酚酸总量明显升高，与文献报道通过杀青灭酶来达到最大程度保留有效成分含量结果相一致[18]；微波未杀青干燥样品，随着干燥温度的升高，酚酸类化学成分总量先降低，后升高，50～60 ℃达低谷；根据以上结果，可推测降解酚酸成分的酶活性随温度变化呈先上升后下降的趋势，50～60 ℃为酶催化氧化的最适温度。
研究表明[19-20]，酚酸类成分苯环上的邻二酚羟基结构不仅易被植物相关酶催化氧化，而在热和氧的作用下，自身可氧化降解，甚至异构变形，导致成分在干燥过程中不断降解。本研究所测定的绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸分子结构中均含有邻二酚羟基的咖啡酰结构。本研究结果显示，红外、热风干燥品，随温度升高酚酸总量降低，而根据酶活性的最适温度在50～60 ℃，当达到70 ℃酶活性理论上降低而酚酸类化学成分总量升高，而结果反之。因此，推测酚酸类化学成分热稳定性差，酶活性降低所引起的成分保留作用小于高温（70 ℃）下成分的热分解作用；而微波70 ℃虽然也为高温，但由于微波干燥速率快，高温作用时间远小于70 ℃下红外和热风干燥，成分热分解减少，故微波干燥酚酸类化学成分总量随温度变化趋势同红外干燥和热风干燥变化不一致。
由于各指标成分含量在不同干燥方法中变化趋势不同，且在数量级上也存在较大差异，简单加和显然不能客观全面反映成品质量，因此需要选择合理的综合评价方法，以兼顾各种成分在质量评价中所占权重均等。TOPSIS分析法是一种较理想的综合评价方法，其中心思想是首先确定各项指标的正理想值A+和负理想值A-，然后求出各干燥方法与正、负理想值之间的加权欧式距离D+和D-，从而求出各干燥方法与理想方案的接近程度Ci，作为评价方案优劣的标准[15]。因此，本研究基于TOPSIS法所得出的薄荷药材适宜干燥方法较简单加和法更能综合反映各种干燥方法所得产品的综合质量。
本研究选用富含挥发油类化学成分的薄荷药材，通过以其所含有的挥发性化学成分单萜类，以及非挥发性化学成分黄酮类、酚酸类等多元功效成分为评价指标，比较不同干燥方法对其药效品质形成的影响，研究结果为薄荷药材产地干燥加工适宜方法的确定提供了依据，同时也为富含挥发油类功效成分的芳香全草类药材适宜干燥方法的选择提供了有益的探索。
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[责任编辑 孔晶晶]