摘 要： 目的：探讨高住低练对线粒体钙转运功能及能量代谢的影响，为运动与低氧适应 机制的研究和高原训练方案的制定提供理论依据。方法：采用荧光技术和生物发光技术分别 测定心肌、肝脏和骨骼肌线粒体Ca2＋浓度和心肌线粒体ATP含量，并用血乳酸分析仪 和血糖仪分别测定血乳酸和血糖浓度。结果：急性低氧应激使线粒体游离Ca2＋浓度 和ATP含量下降，血乳酸明显上升；经过高住低练运动与低氧适应后线粒体游离Ca2＋ 浓度和ATP含量呈上升 趋势，血乳酸上升程度减低，提示依赖糖酵解产能降低，能量代谢产生了适应。结论：高住 低练能使线粒体钙转运功能加强，能量代谢作用得到改善。
关键词：高住低练；线粒体；钙转运；能量代谢
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编 号：1007-3612(2011)03-0056-03
Effects of HiLo Training on the Function of Mitochondria CalciumTransports and Energy Metabolism
HUANG Li ying，WENG Xi quan，LIN Wen tao
(Exercise Biochemistry Section， Guangzhou Institute of Physica l Education，Guangzhou 510500，Guangdong China)
Abstract: Aim: The effects of HiLo training on the function of mitochondria calcium transp orts and energy metabolism were investigated， so that the theory of study on th e mechanisms of hypoxic acclimatization and project of high altitude training isprovided. Methods: The Ca2＋concentration of mitochondria in the heart，liver and skeletal muscle tissue and ATP content were assessed by fluorescenceand bioluminescence techniques， and blood lactate and blood glucose conce ntration were measured by blood lactate analyzer and glucose meters. Results: F ree Ca2＋concentration， ATP content of mitochondria decreased after hypox ic str ess and blood lactic acid increased; Free Ca2＋concentration， ATP contentof mi tochondria increased after 4 week hypoxic acclimatization at altitude 3 000 m a nd significantly after hypoxic training acclimatization， blood lactic acid incr easing a little shows that it depending on energy of glycolytic decreased， ener gy metabolism and energy metabolism developed adaptation. Conclusion: The funct ion of mitochondria calcium transports increased and energy metabolism was impro ved after living high training low.
Key words: Living high training low; mitochondria; calcium transports;energy metabolism
高住低练的高原训练法是运动员训练在低海拔，同时休息在高海拔缺氧低压环境以便使 得机体发生缺氧习服现象，其优点是不会明显降低运动训练的强度，从而提高运动员的运动 能力。研究表明，高住低练能显著增强有氧耐力训练效果，提高有氧能力，目前研究较多的 有最大摄氧量、血红蛋白、促红细胞生长素和有氧代谢酶活等［1-2］，而对线粒体 方面的研究较少，尤其是线粒体钙转运功能及能量代谢的影响作用。当缺血缺氧损伤时，Na +-Ca2＋ 交换及细胞膜通透性增高等原因可造成细胞内钙超载［3］，若此时线粒体功能障碍 、摄钙能 力降低，则不能摄取胞浆中过多的钙，致使细胞浆中游离钙增加，线粒体内游离钙减少，进 一步加重了细胞内钙超负荷，使钙转运功能受损。线粒体游离Ca2＋浓度下降，对有 氧氧化 生成NADH的促进作用减弱，从而影响呼吸链电子传递过程和质子泵功能，引起物质能量代谢 障碍。低氧预适应能提高机体的低氧适应能力，高原训练就是应用了缺血缺氧预适应原理来 提高耐缺氧能力，以致提高运动员竞技水平。为此本实验研究高住低练对线粒体钙转运功能 及能量代谢的影响作用，旨在探讨运动与低氧适应的机制，为高原训练方案的制定提供理论 依据。
1 材料和方法
1．1 动物模型 8周龄雄性SD大鼠40只，随机分为4组，分别为：1）低住安静组；2）低住低练组； 3）急性高住低练组；4）高住低练组，每组大鼠10只。高住低练组（4）每天20:00至次日8 :00居住在常压低氧舱（采用的设备为美国Hypoxicon公司制造），共12 h，其余时间在舱 外常氧中训练或自由活动，训练组（2）、（4）每天在舱外于动物跑台以25 m/min运动、1h /d、5 d/周，共4周。（3）、（4）组采样前进行12 h（前一天20：00至当天8：00）低 氧应激（低氧为14.5%氧含量，相当海拔3 000 m高度）。
投稿日期：2010-04-23
基金项目：2009年广州体育学院院管课题：线粒体电子漏与运动性疲劳 的产生及其消除的分子机制（课题编号：YB0923）。
作者简介：黄丽英，博士，研究方向低氧适应与运动健康的生化。1.2 研究方法
1.2.1 组织样品采集及处理 大鼠断头死后，立即取心肌、肝 脏和骨骼肌组织匀浆，在低温高速离心机中以差速离心法［4］分离线粒体待测各指 标。
1.2.2 线粒体内游离钙的测定（荧光分光光度法，以Fura-2AM为荧光染料，购自Sigma公 司。）提取的线粒体用负载介质制成悬浮液，加Fura-２ＡＭ混匀，在3℃水浴中温育10 min，并不 断振摇，以0～4℃离心，并用预冷的180 mmol/L KCl溶液洗涤两次除去多余的Fura-２ＡＭ ，并将负载Fura-2的 线粒体悬浮于测试介质中。激发波长340 nm,380 nm,发射波长505 nm ，狭缝10 nm，在荧光分光光度计上测定。
1.2.3 线粒体ATP含量的测定(生物化学发光法)每一个荧光素分子与荧光素酶反应，消耗一分子氧，释放一分子二氧化碳，发射一个光 量子。在体外反应中，固定荧光素与荧光素酶的量，则产生的光强度与系统ATP的含量成正 比，从而可以定量检测样品中ATP的含量。荧光素酶-荧光素购自上海中科院植物生理研究所 。
1.2.4 血乳酸和血糖的测定 采用血乳酸分析仪和血糖仪分别 测定血乳酸和血糖浓度。
1.2.5 统计学处理所有数据在SPSS11.0软件上进行统计，采用独立样本T检验，以平均数±标准差(X±S)来表示。
2 结果与分析
2.1 高住低练对大鼠心肌、肝脏和骨骼肌线粒体游离Ca2＋浓度的影响 与低住安静组比较，组4心肌线粒体内游离钙呈极显著性升 高(p<0.01 )；与低住低练组比较，组3骨骼肌呈极显著性降低(p<0.01)，组4心肌呈显著性升高(p<0. 05)；与急性高住低练组比较，组4心肌和骨骼肌呈显著性升高(p<0.05)(表1)。
表1 心肌、肝脏和骨骼肌线粒体游离Ca2＋浓度nmol/mgpr
序号 组别n心肌肝脏骨骼肌1低住安静组10347.9 767±
40.1 241309.9 424±
75.4 5173 47.9 767±
40.1 2412低住低练组10379.6 133±
47.3 095373.0 550±
80.1 3923 79.6 133±
47.3 0953急性高住低练组10347.3 360±
47.7 442309.0 025±
28.1 274 294.3 080±
48.8 929##4高住低练组10459.5 700±
59.1 401**#Δ483.2 942±
108.1 774*Δ338.5 686±
3 8.0 387
*p<0.05,**p<0.01与组1相比；#p<0.05,##p<0.01与组2相比；Δp<0.05, ΔΔ p< 0.01与组3相比。下表同。
2.2 高住低练对大鼠能量代谢指标的影响 经过海拔3 000 m高住低练适应后，心肌线粒体ATP含量呈显著性升高(p<0.05)；与急性 高住低练组比较，组4的ATP含量呈极显著性升高(p<0.01)。与低住安静组比较，高住低练 组血乳酸极显著性增加(p<0.01)，经过低氧适应后，血乳酸上升幅度减少。高住低练组 血糖浓度变化不明显(表2)。
3 讨 论
高原训练的目的是通过运动和低氧环境的双重刺激，使机体产生耐缺氧能力，从而提高 有氧耐力等运动水平。研究表明,在缺血缺氧损伤中线粒体总钙超载及线粒体内游 离钙减少引起细胞损伤，从而影响能量代谢。在运动和低氧环境干预下，线粒体钙转运功能 和能量代谢变化又如何呢？本实验设计大鼠低氧应激和运动训练模型，模拟高住低练对线粒 体钙转运功能和能量代谢的影响作用，探讨运动与低氧适应的机理，我们通过实验观察得到 以下的结果。
表2 心肌线粒体ATP含量、血乳酸和血糖浓度
序号 组别n心肌线粒体ATP
含量/ng•mg•pr-1血乳酸
/mmol•L- 1血糖
/mmol•L-11低住安静组10260.8 065±
66.9 0821.7 004±
0.9 6314.0364±
0.4 8632低住低练组10296.2 320±
51.4 7602.1 264±
0.8 1724.0111±
0.8 1463急性高住低练组10191.7 112±
30.8 9864.5 317±
1.4 702**4.6 250±
0.5 3154高住低练组10321.0 652±
28.8 982*ΔΔ4.0 475±
0.5 953**##Δ3.7 667±
0.4412Δ3.1 高住低练对大鼠线粒体钙转运功能的作用生理条件下线粒体通过有效的Ca2＋摄取和释放维持其钙稳态，同时参与细胞代谢的 调 节。缺血缺氧损伤时，因Na+-Ca2＋交换及细胞膜通透性增高等原因可造成细胞内 钙超载， 若此时线粒体功能障碍、摄钙能力降低，则不能摄取胞浆中过多的钙，致使细胞浆中游离钙 增加，线粒体内游离钙减少，进一步加重了细胞内钙超负荷，使钙转运功能受损。因此，心 肌线粒体在缺血性病变或体外缺血再灌注情况下，心肌线粒体钙摄取能力下降［5］。我们的 实验观察到急性低氧应激心肌、肝脏和骨骼肌线粒体游离Ca2＋浓度有下降趋势，线 粒体内 游离钙明显减少，摄钙能力显著降低［6］，说明线粒体膜损伤较严重，膜的通透性 增加，钙 离子漏出增多，同时膜结构的破坏导致了线粒体摄钙能力的降低，这与我们观察心肌细胞超 微结构研究结果［7］相吻合。线粒体内钙稳态的失调,是造成线粒体损伤的重要原因 之一,力竭运动可造成线粒体内钙稳态的失调，有关急性运动对线粒体钙稳态的影响已有不 少报导［8］。若能保持线粒体的结构不受损伤，维持其摄钙能力，则能起到调节 细胞内钙变化 ，减轻细胞内钙超载的作用。本文研究发现高住低练组心肌、骨骼肌和肝脏线粒体游离Ca 2＋基本恢复到低住安静组水平，且心肌线粒体游离Ca2＋浓度上升显著(p<0 .05)，说明经过4周海拔3 000 m高住低练适应后钙离子转运功能有所提高。因此，高住低 练能使心肌线粒体游离Ca2＋增加，提高线粒体钙的转运能力。
3.2 高住低练对大鼠能量代谢的作用钙离子转运功能的改变与能量代谢作用密切相关，当线粒体游离Ca2＋浓度下降，有 氧 氧化生成NADH的促进作用减弱，从而影响呼吸链电子传递过程和质子泵功能。有研究表明， 急性缺氧使线粒体氧化磷酸化功能受损，ATP生成减少［9］。我们的实验观察发 现，急性 低氧应激后，心肌线粒体ATP含量下降，加上运动负荷的双重作用，ATP含量下降加剧［ 6］。 缺血时线粒体氧化磷酸化不能有效进行，ATP生成减少而水解增多，细胞因能量不足发生功 能障碍。随着缺血时间延长，线粒体结构和功能受损，ATP耗竭，细胞功能进一步损伤，甚 至发生细胞凋亡。缺血再灌注时，首先是缺血条件下胞浆Ca2＋浓度一定程度的升高 ，其主要原因是细胞膜Na＋K＋-ATPase活性下降，Na＋排出减少，同时细胞内酸中毒 ，Ｈ＋升高，通过Na＋Ｈ＋交换细胞摄取Na＋增加。两者作用的结果，细胞内Na ＋浓度升高，进而通过Na+-Ca2＋交换使细胞内Ca2＋升高。心肌缺血时，Ca 2＋还可通过慢钙通道进入细胞内，同时肌浆网Ca2＋-ATPase活性下降。ATP酶 存在于组织细胞膜及细胞器膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及 信息传递方面具有重要的作用，机体在缺O2及一些疾 病状态下，此酶活力发生一系列改变。高文祥等报导急、慢性缺氧组动物分别连续暴露于模 拟4 000 m高原，结果急性缺氧大鼠Ⅳ态呼吸(ST4)显著升高，伴呼吸控制率(RCR)降低 ，同 时线粒体内ATP含量、ATP生成率和F0F1-ATP酶活性均显著降低；慢性缺氧大鼠ST4、RCR、线 粒体ATP含量和F0F1-ATP酶活性部分恢复［10］，我们前期的研究结果与其相符，模 拟3 000 m的低氧环境，急性低氧应激后线粒体ATP含量和ATP酶活性下降［6］。Rob ert等实验发现预缺 氧可增加动物心肌组织腺苷含量，本文实验观察到没有经过低氧适应，尽管进行了运动适应 ，当低氧应激后线粒体ATP含量还是受影响；经过慢性低氧和运动适应4周后，线粒体ATP含 量显 著性上升(P<0.05)(表2)。由此我们推测：高住低练后心肌线粒体ATP含量的提高，可 能 和腺苷生成增加，引起冠脉扩张并提高心肌供氧，糖酵解作用减弱，从而解除了对苹果酸穿 梭系统的抑制有关。苹果酸穿梭系统恢复以后，ＮＡＤＨ氧化脱氢得以顺利进行，增加了呼 吸链的电子传递，因而改善了线粒体呼吸功能，增加线粒体ATP的生成。Na＋K＋-ATPas e镶 嵌于线粒体内膜，是保证线粒体结构和功能的重要离子泵，罗刚等（1999）发现预缺氧动物 该酶活性明显提高，与线粒体膜流动性呈正相关，提示预缺氧动物心肌线粒体膜结构损伤减 轻，膜流动性增加可能和Na＋K＋-ATPase活力的恢复有关。这也可能是我们观察到高住 低练 组大鼠心肌线粒体膜结构损伤减轻的原因。缺血使组织细胞不能获取足够的氧，导致线粒体 氧化磷酸化不能有效进行。细胞磷酸肌酸很快耗竭，并释放出大量的无机磷，促进糖酵解及 乳酸生成，导致细胞内pH下降，细胞酸中毒。由于低氧环境的刺激，肾上腺素敏感性增强， 糖酵解代谢旺盛，血乳酸浓度增高。我们实验观察到大鼠在低氧环境生活12 h，乳酸增加 ［6］，同时本实验发现急性高住低练组血乳酸浓度升高更为明显，表明此时糖酵解作 用加 强。 Brooks认为高原暴露更多依赖血糖供能，高原适应后糖酵解下降是由于骨骼肌摄取血糖增加 的结果［11］。本文实验观察到急性高住运动组血糖浓度呈显著性升高(p<0.05 )，高住低练组 变化不明显，提示经过高住低练血糖浓度又回升到正常水平，这可能是对低氧环境产生了适 应。
能量代谢障碍是缺氧性心肌等组织损伤的基础，生物膜损伤在组织缺氧—复氧损伤中起 重要作用，缺氧组织能否恢复其功能主要取决于ATP的水平，当发生组织缺氧—复氧损伤时 ， 由于ATP生成量减少，能量合成发生障碍，而ATP对维持膜的完整性、收缩和细胞内外离子的 恒定方面至关重要［12，13］。因此，能量代谢障碍是缺血缺氧性组织损伤的重要 环节，同时 伴有氧自由基的异常增生，形成恶性循环。由上述的研究结果可知，高住低练对线粒体钙离 子转运功能及能量代谢的影响机制可能是：游离Ca2＋是钙调节细胞内能量转换的主 要功能 形式，急性低氧应激时，游离Ca2＋减少，则对基质中钙敏感代谢步骤(丙酮酸脱氢酶 系、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶)的激活作用减弱，Ca2＋刺激线粒体ATP等 生成作用降低，使能量转换功能暂时降低；经过反复的低氧刺激和运动适应后，线粒体游离 Ca2＋上升，能量代谢得到改善，从而使钙转运功能加强，能量代谢作用提高。由此 可见，高住低练能改善机体的能量代谢水平，提高低氧适应能力。
4 结 论
1)通过高住低练的低氧和运动适应，能提高大鼠心肌、骨骼肌和肝脏线粒体游离Ca2＋ 的浓 度，对有效的Ca2＋摄取和释放、维持钙稳态，细胞代谢的调节起了重要的作用，从 而因而线粒体钙转运功能得到加强使线粒体钙转运功能得到加强；
2）通过高住低练的低氧和运动适应，能高住低练提高大鼠心肌线粒体ATP的含量，保证低氧 时能量的供应，加快缺氧组织功能的恢复；血乳酸上升程度减低，提示依赖糖酵解产能降低 ，能量代谢作用有所提高。因此，高住低练能使钙离子转运功能增强与能量代谢改善，提高 了机体的低氧适应能力。
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