[摘要] 应用NanoLCLTQOrbitrap技术的蛋白质组学法探索人参干预“气虚”大鼠的生物学基础。采用“限食+游泳过度”的方法建立气虚大鼠模型，运用NanoLCLTQOrbitrap纳升液相质谱联用检测系统分析空白组、气虚模型组、人参组大鼠股外侧肌肉组织全蛋白。Protein Discovery软件进行蛋白质鉴定，SIEVE软件对所有样本蛋白进行相对定量分析。人参组与模型组相比较共发现26个与空白组趋势一致的显著差异蛋白，通过生物学功能分析发现，其主要可归为能量代谢相关蛋白、糖代谢相关蛋白、电解质平衡及物质转运相关蛋白、炎症相关蛋白和细胞骨架相关蛋白等。以上相关蛋白靶点及其涉及的生物体调控通路可能是人参对机体“气虚”症候发挥补气作用的生物学基础。
[关键词] NanoLCLTQOrbitrap； 气虚； 人参； 蛋白质组学
中医基础理论认为：“气”是构成人体和维持人体生命活动的最基本物质，流转于全身各脏腑、经络等组织器官，不断的推动和激发着人体的各种生理活动[12]。“气”之不足，脏腑组织功能、机体活动则明显减退。现代医学研究亦表明，气虚与高血压、糖尿病、冠心病、慢性心衰、中风、急性脑梗塞、乳腺癌等多种疾病的发生有着密切的关系[23]。探索“气虚”症候及其治疗机制的科学内涵是中医中药现代化研究的重要内容。
人参为《神农本草经》首上品，“补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智”[4]。其大补元气之功，向来备受历代医家推崇。
蛋白质组学（proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能的新兴学科[5]，是继基因组之后又一重要生命科学研究领域，也是功能基因组时代的核心内容之一，为生物系统重要组成部分。其以“整体、系统”为特点的组学方式探索蛋白层面变化规律与中医症候“整体观”、中药治疗“多靶点”格局十分吻合[6]。
传统的蛋白质组学实验[7]采用基于双向电泳的蛋白质分离方法与常规质谱检测技术，难以实现真正意义上的高通量，高精准无缝衔接的组学研究。本实验在中医药理论指导下，采用NanoLC耦合LTQOrbitrap质谱检测系统，运用比较蛋白质组学方法寻找人参调节“限食+游泳过度”所致气虚动物的差异蛋白，结合生物学功能分析，探索人参大补元气的生物学基础。
1 材料
1.1 动物
SD大鼠，雌雄各半，体重230～250 g，SPF级，由湖南斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）20130004。
1.2 药品与试剂
人参颗粒（广东一方制药有限公司，批号401208T）；乙腈（HPLC级，德国默克，批号JAO28730）；甲酸（Sigmaaldrich，USA，批号BCBP4740V）；RIPA高效裂解液（Thermo Pierce，批号QB212494）；苯甲基磺酰氟（PMSF）（Thermo Pierce，批号QE2016716）；二硫苏糖醇（Thermo scientific，批号QE217272A）；碘代乙酰胺（Thermo scientific，批号QE216501）；测序级胰酶（Promega，USA，批号0000153715）；乙酸（HPLC级，Sigmaaldrich，USA，批号BCBN4472V）；丙酮（HPLC级，国药集团，批号40064460）；碳酸氢铵粉末Sigmaaldrich，USA，批号BCBN6056V）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo scientific，USA，批号QH220534A）。
1.3 仪器
ORBITRAP ELITE质谱仪（Thermo公司）；EASYnLC 1000液相仪（Thermo公司）；分析天平（梅特勒公司）；C18旋转柱 （Thermo Pierce公司）；D37520高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；ELX800吸收光酶标仪（美国BioTek仪器有限公司）；离心浓缩仪（LABCONCO，美国）；EASYSpray Column（Thermo，美国）；Acclaim PepMap 100（Thermo，美国）。
2 方法
2.1 实验造模、分组及给药[8]
实验前将所有动物进行预游泳，剔除差异大的动物，保留游泳时间在10～50 min的合格大鼠。将合格大鼠按体重随机分为空白组、气虚模型组、人参组，每组10只。除空白组外，其余大鼠每天上午8：00、晚上6：00置于恒温水槽[（23±1）℃，水深40 cm]中负重（8%）力竭（游泳最后下沉，经10 s后仍不能返回水面即为力竭）游泳，并隔日禁食，隔日按100 g·kg-1·d-1饲料量饲养，连续16 d。人参组在造模的同时灌胃给予生药量1.62 g·kg-1。空白组大鼠正常给食，每天灌等容积蒸馏水。完成实验后，每组选取疗效确切的3只大鼠进行蛋白组学实验（本实验方案已经江西中医药大学伦理委员会批准）。
2.2 蛋白样品处理
2.2.1 肌肉组织全蛋白的提取 精密称取大鼠股外侧肌肉组织0.12 g，置于-20 ℃预冷的研钵中，粗略研磨后加入1 mL裂解液（RIPA裂解液PMSF 100∶1），液氮中研磨成浆液后，转移至1.5 mL离心管中，摇床上4 ℃，中速摇晃40 min，使组织充分裂解。4 ℃ 14 000×g离心40 min，弃去沉淀，上清液即为肌肉组织蛋白。
BCA法测定各样品蛋白浓度并于-80 ℃保存备用。
2.2.2 蛋白质的酶解 蛋白样品4 ℃下融化，取20 μL，加入适量DTT溶液，37 ℃水浴60 min。加入适量IAA溶液，避光反应45 min。加入5倍量体积冰丙酮，-20 ℃沉淀过夜。样品4 ℃ 14 000×g离心10 min，弃去上清液，加入1.0 mL丙酮，涡旋混匀，4 ℃ 14 000×g离心10 min，弃去上清液。反复3次以清洗蛋白质。将蛋白质重悬于100 mmol·L-1碳酸氢氨溶液600 μL中，按照酶蛋白1∶50加入测序级胰酶，37 ℃水浴酶解过夜。加入适量5%乙酸，使pH小于6以终止酶解反应。
2.2.3 多肽的除盐及冻干 将酶解完的样品按照Pierce C18 Spin Columns说明书中的步骤进行脱盐处理，最后将多肽洗脱液用离心浓缩仪进行冷冻干燥，-20 ℃保存备用。
2.2.4 样品检测 用0.1%甲酸溶液80 μL溶解样品，NanoLCLTQOrbirap联用系统对蛋白样品进行检测。
色谱条件：分析柱为EASYSpray C18色谱柱（75 μm×15 cm，3 μm），预柱为Acclaim PepMap 100（C18，75 μm×2 cm，3 μm）。流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为0.1%甲酸乙腈。进样量2 μL，流速300 nL·min-1，柱温40 ℃。蛋白样品流动相浓度梯度见表1。
LTQ Orbitrap Elite质谱条件：正离子模式，喷雾电压1.9 kV，毛细管温度250 ℃。一级图谱开启FTMS扫描模式，二级图谱35%的碰撞能量，采用Ion trap1拖20的扫描模式，扫描范围300～1 800。
2.3 数据分析方法
将LCMS所收集到的RAW文件导入Protein Discovery软件进行蛋白质鉴定，再运用SIEVE软件对不同组别的蛋白进行相对定量定性分析。
3 结果
3.1 LCMS总离子流图
与空白组相比较，气虚模型组大鼠样本的TIC图从外观上有一定差异；与气虚模型组相比较，人参组大鼠样本的TIC图也有一定差异，见图1。
3.2 聚类分析
空白组与气虚模型组大鼠组间分离度较好，且组内聚合度较高；人参组与模型组大鼠组间分离度也较好，组内聚合度较高，见图2。结果表明肌肉组织蛋白在处理过程中方法稳定性高且选取样本较为合理性。
3.3 肌肉组织差异蛋白质的分析
空白组、气虚模型组及人参组肌肉组织共检测到2 768个蛋白。以气虚模型组（M）为对照，空白组（K）及人参组（G）与气虚模型组差异蛋白见表2。
4 讨论
气虚模型的选择是本课题首先要解决的关键问题，目前气虚证的造模方式有很多，如限制日摄食量法、单纯泻下法、疲劳法、烟熏法、化疗药物法、X线照射、偏食苦味、耗气破气、苦寒泻下加耗气破气降气、失血法等[8]。造模方法虽然很多，但大多较复杂，利用多因素造模较多，造模时间亦长，在实验过程中不利于操作；有些造模因素虽然符合中医理论，但与临床不贴近，如偏食苦味造模，食用过量醋造模等并不是临床上常见的导致气虚的原因；还有一些方法所造的模型是否属于气虚证还存在着争论，各有说法，如泻下法是一种常用的气虚造模方法，但所用泻下药物大黄、番泻叶等性苦寒，不能排除造成脾阳虚的可能；有些方法所用强度和时间都不同，各有不同的标准，不够统一。
本实验采用限食+疲劳法制作气虚动物模型，限食可致“气”的生成不足，“ 人之所受气者，谷也”（《灵枢· 玉版篇》，“ 谷不入半日则气衰，以日则气少矣。”（《灵枢· 五味篇》，而“劳则气耗”（《素问·举痛论》，比较符合中医基础理论，且实验周期较短，容易控制造模程度。
本实验发现的差异蛋白中较多与能量、糖代谢、物质转运相关，这一结果与许多现代医学研究较为一致[912]。差异蛋白功能具体探讨如下。
4.1 能量代谢相关蛋白
与空白组相比较，气虚模型组肌酸激酶M型、苹果酸脱氢酶、线粒体ATP合成酶、丙酮酸脱氢酶、细胞色素C等影响机体能量代谢重要蛋白[910]含量显著降低，提示气虚模型大鼠能量代谢异常；与气虚模型组相比较，人参组肌酸激酶M型、苹果酸脱氢酶、线粒体ATP合成酶、丙酮酸脱氢酶、细胞色素C含量显著升高，提示气虚模型大鼠的能量代谢异常情况经补气药人参干预后可以得到明显改善。
4.2 糖代谢相关蛋白
与空白组相比，气虚模型组β烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶等糖代谢过程的关键酶[11]表达下调，提示气虚模型大鼠机体葡萄糖代谢出现障碍；与气虚模型组相比，人参组β烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶表达显著上调，提示人参组在糖代谢方面能起到相应调节作用。
4.3 电解质平衡及物质转运相关蛋白
碳酸酐酶是一类具有催化碳酸脱水反应和水合反应作用的酶，可以调节组织内电解质和酸碱平衡。本实验结果表明，与空白组相比，气虚模型组碳酸酐酶表达下调，说明气虚模型大鼠机体出现病变；与气虚模型组相比，人参组碳酸酐酶表达显著上调，提示补气药组能够调节气虚模型大鼠的身体状况。
白蛋白是血浆中的重要载体蛋白，许多水溶性差的物质可以通过与白蛋白结合而被运输。与空白组相比，气虚模型组白蛋白表达下调，说明气虚模型大鼠物质转运功能失衡；与气虚模型组相比，人参组白蛋白表达显著上调，提示人参能够调节气虚模型大鼠物质转运过程。
4.4 炎症相关蛋白
HSP70 除了具有分子伴侣的功能， 在调节炎症中也起着重要作用，可通过抑制炎症信号通路中关键蛋白的活性而抑制脑内炎症反应[12]。与空白组相比，气虚模型组HSP70表达下调，说明气虚模型出现炎症过程和免疫失衡；与气虚模型组相比，补气药组HSP70表达显著上调，提示补气药组能够调节气虚模型大鼠炎症过程和免疫过程。
4.5 细胞骨架相关蛋白
与空白组相比，气虚模型组白蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白表达下调，说明气虚模型大鼠相关细胞骨架蛋白遭到分解破坏；与气虚模型组相比，人参组肌球蛋白、肌钙蛋白表达显著上调，提示补气药组能够调节气虚模型大鼠细胞骨架蛋白，从而对细胞进行保护作用。
综上所述，本实验研究所发现的功能差异蛋白及其调控的相关生物转化通路可能为机体气虚及人参补气作用的生物学基础之一。
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[责任编辑 马超一]