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[摘要] 目的 探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肾脏线粒体氧化应激损伤的影响及相关机制。 方法 将SD大鼠分为三组，正常对照组（NC组）、糖尿病对照组（DM组）和养阴活血方药治疗组（NYPBR组），后两组应用链脲佐菌素（STZ）制造糖尿病大鼠模型。NYPBR组大鼠给予养阴活血方药防治。10周末，测定各组大鼠血糖、体重、肾重、血肌酐（SCr）、24 h尿蛋白，检测肾脏线粒体丙二醛（MDA）含量及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮合酶（NOS）、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，透射电镜观察肾组织超微结构变化。 结果 与NC组比较，DM组大鼠肾脏线粒体MDA[（1.34±0.24）nmol/mg]、GSH-Px[（57.63±4.91）U/mg]及NOS[（0.81±0.07）U/mg]明显升高（均P < 0.01），Na+-K+-ATP酶[（1.40±0.10）μmol/（mg·h）]、Ca2+-Mg2+-ATP酶[（1.43±0.10）μmol/（mg·h）]和SDH[（24.33±2.31）U/mg]显著降低（均P < 0.01），肾功能减退，肾脏组织发生病理性改变，线粒体出现损伤。养阴活血方药可显著改善上述变化，NYPBR组的MDA[（0.81±0.08）nmol/mg]、GSH-Px[（50.55±5.86）U/mg]及NOS[（0.72±0.07）U/mg]均低于DM组（P < 0.01或P < 0.05），Na+-K+-ATP酶[（1.66±0.18）μmol/（mg·h）]、Ca2+-Mg2+-ATP酶[（1.76±0.20）μmol/（mg·h）]和SDH[（40.92±3.77）U/mg]明显上升（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 糖尿病大鼠肾脏线粒体存在明显的氧化应激损伤，NYPBR可显著减轻糖尿病大鼠肾脏线粒体损伤，此作用可能与降低NOS活性，提高SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性有关。
[关键词] 糖尿病肾病；线粒体；氧化应激；养阴活血方药
[中图分类号] R587；R692.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）06（b）-0024-04
Effect of Nourishing Yin and Promoting Bloodflow Recipe on the oxidative stress injuries in renal mitochondria of diabetic rats
LIANG Jinhuan YANG Xiaohui ZHAO Li"na MENG Chenyang CUI Yunpeng LIU Boling
Cangzhou Medical College， Hebei Province， Cangzhou 061001， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of Nourishing Yin and Promoting Bloodflow Recipe （NYPBR） on the oxidative stress injuries in renal mitochondria of diabetic rats and related mechanism. Methods SD rats were divided into 3 groups： normal control group （NC group）， diabetes control group （DM group） and NYPBR group， the latter 2 groups diabetes rat models were created by streptozotocin （STZ）. The NYPBR group was treated with NYPBR. At the end of 10 weeks， blood sugar， body weight， kidney weight， serum creatinine （SCr）， 24-hour urine protein were measured， and content or activity of renal mitochondria MDA and glutathion peroxidase （GSH-Px）， nitric oxide synthase （NOS）， ATPase and succinate dehydrogenase （SDH） were determined for each of the 3 groups， and ultrastructure of renal tissue was observed with transmission electron microscope. Results Compared with NC group， renal mitochondria MDA [（1.34±0.24） nmol/mg]， GSH-Px [（57.63±4.91） U/mg] and NOS [（0.81±0.07） U/mg] of DM group were elevated significantly （all P < 0.01）， the activities of Na+-K+-ATPase [（1.40±0.10） μmol/（mg·h）]， Ca2+-Mg2+-ATPase [（1.43±0.10） μmol/（mg·h）] and SDH [（24.33±2.31） U/mg] decreased greatly （all P < 0.01）， and there were renal pathological changes and mitochondria injury. NYPBR could improve the changes. Compared with DM group， renal mitochondria MDA [（0.81±0.08） nmol/mg]， GSH-Px （50.55±5.86） U/mg] and NOS [（0.72±0.07） U/mg] of NYPBR group were decreased significantly （P < 0.01 or P < 0.05），Na+-K+-ATPase [（1.66±0.18） μmol/（mg·h）]， Ca2+-Mg2+-ATPase [（1.76±0.20） μmol/（mg·h）] and SDH [（40.92±3.77） U/mg] elevated greatly （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Oxidative stress injuries occur in diabetes rat mitochondria. NYPBR may significantly decrease the injuries of diabetes rat renal mitochondria， which may be related to decreasing in NOS activity， and increasing in SDH， Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase.
[Key words] Diabetic nephropathies； Mitochondria； Oxidative stress； Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）即糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病特发性全身微血管病变的肾脏表现，是糖尿病最常见和最严重的慢性并发症之一，已成为导致慢性肾衰竭的最主要原因。DN的发病机制，目前尚不完全清楚，随着对DN研究的深入，发现氧化应激在DN发病机制中起重要作用[1-2]。线粒体既是生物氧化及能量转换的主要场所，也是产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要部位[3]。近年来，线粒体作为氧化应激的重要细胞器而备受关注。本实验拟通过建立糖尿病大鼠模型，观察养阴活血方药（Nourishing Yin and Promoting Bloodflow Recipe，NYPBR）对糖尿病大鼠肾功能、肾脏线粒体形态与功能及氧化应激指标丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及一氧化氮合酶（NOS）水平的改变，探讨NYPBR对糖尿病大鼠肾脏线粒体的影响及可能机制，为临床防治DN提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
血糖检测仪（强生公司），链脲佐菌素（STZ Sigma公司产品），肌酐（SCr）、尿蛋白定量、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒及MDA、GSH-Px、ATP酶、琥珀酸脱氢酶（SDH）和NOS测试盒均购自南京建成生物工程研究所，线粒体提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，NYPBR由熟地20 g、牡丹皮20 g、山药15 g、山萸肉10 g等中药组成，常规水煎成1000 g/L生药浓度药液[4]。
1.2 糖尿病动物模型建立及分组
选择体重250～300 g、4月龄健康雄性SD大鼠（河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号：809091），将其分为两组：正常对照组（NC组，n = 8）；造模组：腹腔注射STZ溶液，注射后3 d尾静脉血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L，且能维持1周以上，确定糖尿病模型。将成模大鼠随机分为糖尿病对照组（DM组，n = 10）和NYPBR组（n = 10）。NYPBR组按人和动物间体表面积折算的等效剂量灌喂给药，每只大鼠3 mL/d。实验期间所有大鼠均正常饲料喂养，自由饮水。
1.3 样本采集
造模成功10周结束，收集各组大鼠24 h尿液，称重，检测血糖；股动脉放血，收集血标本，分离肾脏并称重；取小块肾皮质，4%戊二醛固定，以备电镜观察；余下肾皮质-80℃保存，待提取线粒体。
1.4 实验检测
造模72 h及取材前尾静脉取血，检测血糖；测定大鼠体重及肾重，计算肾肥大指数，肾肥大指数=肾重/体重。测定24 h尿蛋白、血SCr。差速离心法提取线粒体，考马斯亮蓝法测定线粒体蛋白质浓度，检测线粒体MDA含量，测定线粒体GSH-Px、NOS、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及SDH的活性。均严格按照试剂盒说明书操作。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两组比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
实验期间，糖尿病大鼠多饮、多食、尿量增加、生长缓慢等症状明显。10周病程结束时，与NC组比较，DM组血糖明显高于NC组，体重减轻，肾肥大指数增大，同时24 h尿蛋白和SCr均显著增高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与DM组比较，NYPBR组血糖降低但无显著变化（P > 0.05），体重显著升高，肾肥大指数降低，24 h尿蛋白定量和SCr均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。
2.2 各组大鼠肾脏线粒体MDA、GSH-Px与NOS水平比较
与NC组比较，DM组MDA、GSH-Px与NOS水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与DM组比较，NYPBR组MDA、GSH-Px和NOS水平均下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。
表2 各组大鼠肾脏线粒体MDA、GSH-Px与NOS水平比较（x±s）
2.3 各组大鼠肾脏线粒体SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较
与NC组比较，DM组SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与DM组比较，NYPBR组SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。
表3 各组大鼠肾脏线粒体SDH、Na+-K+-ATP酶
及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的变化（x±s）
2.4 肾皮质形态学变化
NC组未见明显异常；DM组可见肾小球基底膜均质性增厚，系膜基质增多，足突融合；肾小管上皮细胞细胞质水肿，细胞器数量减少，排列紊乱，微绒毛轻度减少，线粒体部分嵴、膜排列紊乱，融合或消失；NYPBR组病理变化较DM组明显减轻（图1）。
图1 各组大鼠肾脏超微结构变化
3 讨论
随着糖尿病发病率的逐年提高，DN已成为导致慢性肾功能衰竭的主要原因。多种复杂机制介导了DN的发生，如蛋白非酶糖基化、醛糖还原酶的激活、多元醇途径的增加、PKC激活等，氧化应激被认为是重要的共同机制[3]。线粒体是细胞内产生ROS的主要细胞器，其自身的酶、蛋白质、脂质及DNA等大分子物质也成为ROS直接攻击目标，而损伤的线粒体又会激发ROS的生成，形成恶性循环，影响线粒体的结构和功能[5]。线粒体氧化损伤可能在DN的发病机制中起着重要作用。
线粒体被称为细胞的“动力加工厂”，生命活动所需ATP 95%来自于线粒体，在细胞代谢、应激等生命活动中发挥重要作用。线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶存在于线粒体内膜，Na+-K+-ATP酶催化Na+与K+的逆向转运，Ca2+-Mg2+-ATP酶则将Ca2+从胞浆转运至线粒体基质内，二者共同维系线粒体膜内外的离子平衡。Na+-K+-ATP酶与Ca2+-Mg2+-ATP活性的变化反映着线粒体结构与功能的改变[6]。SDH是三羧酸循环中唯一与线粒体内膜结合的酶，又是线粒体氧化呼吸链4种蛋白酶复合体之一，其活性的变化影响着能量代谢，也是反映线粒体功能的重要标志酶[7]。实验结果显示，糖尿病大鼠肾脏线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和LDH活性均显著降低。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的下降，会引起线粒体对Ca2+的摄入减少，胞质中Na+增加、Mg2+降低，导致线粒体膜内外离子分布状态失衡及水积聚，破坏线粒体的结构；同时，胞质中Na+增加，Mg2+降低，又会使Na+-Ca2+交换加强，Mg2+的拮抗作用降低，导致胞质内Ca2+的持续升高，进而激活一系列蛋白激酶，影响物质代谢及细胞功能，最终导致组织细胞的损伤和死亡。本实验通过电镜观察到糖尿病大鼠肾脏已出现肾小管上皮细胞细胞质水肿，细胞器数量减少，线粒体部分嵴、膜排列紊乱、融合或消失等病理现象。实验表明糖尿病大鼠已发生线粒体损伤。
线粒体是细胞呼吸的主要场所，通过氧化磷酸化生成ATP的同时，0.2%～2.0%的氧经呼吸链电子漏途径产生ROS，成为细胞ROS最主要来源[3]。ROS主要包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH-）、过氧亚硝酸基（ONOO-）等。随着DM的进程，高渗状态、晚期糖基化终末产物（AGEs）等可增强ROS的产生[8]。本实验显示，10周末，糖尿病大鼠肾脏线粒体MDA含量显著升高，分解过氧化物的GSH-Px活性过度表达，说明线粒体ROS生成明显增多，同时线粒体NOS被过度激活，表明线粒体处于明显的氧化应激状态。NOS存在3种同工酶：内皮型NOSⅠ、NOSⅡ和NOSⅢ，线粒体NOS位于线粒体内膜基质。适宜浓度的NO作为信号分子与O2相互作用调节线粒体ATP的生成及钙稳态，而过量的NO则会引发氧化应激损伤[9]。在实验中，糖尿病大鼠肾脏线粒体NOS活性增加，可导致NO水平升高，过量生成的NO与O2-可迅速反应生成ONOO-，对线粒体发生不可逆的氧化硝基化损伤[10]。在线粒体内已发现多种蛋白质可被ONOO-硝基化，如酶复合体Ⅰ、酶复合体Ⅱ、酶复合体Ⅲ、ATP合酶、cytc、Mn-SOD等[11-12]。ONOO-对线粒体蛋白质的硝基化作用，可直接影响线粒体膜电位、氧化磷酸化、Ca2+的稳态等，造成线粒体结构与功能的改变，加重细胞损伤。
糖尿病肾病属中医“消渴”病之“下消”范畴。实验根据本病肾阴亏损终致阴阳两虚的病理转归立法处方。方中以熟地滋肾填精，山萸肉固肾益精，山药滋补脾阴、固摄精微，不使水谷精微下注，三药并用，效六味地黄丸三阴并补而重在补肾阴之意，且配丹皮等以清泄肝火，温补肾阳，固精泄浊。诸药并用，共收阴阳并补、摄精泄浊之功。中医辨证论治，加减灵活，且安全性高、毒副作用小，本实验应用中医药在防治糖尿病肾病方面做了有益探讨。实验结果表明，NYPBR能显著降低糖尿病大鼠肾脏线粒体氧化应激水平，提高线粒体SDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，改善线粒体功能，延缓和减轻DN的发展。
本实验结果表明，糖尿病大鼠肾脏线粒体氧化应激水平与线粒体损伤程度及肾功能紊乱相一致，提示氧化应激造成的线粒体损伤可能是造成糖尿病时肾脏损伤的重要机制，NYPBR能显著减轻糖尿病大鼠肾脏线粒体损伤，其保护机制可能与其能有效地降低线粒体NOS活性，提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和SDH活性有关，其具体机制尚待进一步研究。
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（收稿日期：2015-02-22 本文编辑：张瑜杰）