摘 要 在SDS法的基础上，以富含多糖、多酚等次生代谢物质的香蕉叶片为材料，通过选择性添加适量5 mol/L KAc（pH4.8）或不同体积无水乙醇分别提取香蕉叶片总核酸、总RNA（不含DNA）和总DNA（不含RNA）。结果表明：不添加KAc的可提取到总核酸；添加1/3体积和2/3体积的KAc得到总RNA，添加1/3体积无水乙醇处理得到总DNA。该结果获得一种简单、快速，能在1次实验中添加不同试剂提取香蕉叶片总核酸、总RNA和总DNA的新方法。
关键词 香蕉叶片；总核酸；总RNA；总DNA；快速提取
中图分类号 S668.1 文献标识码 A
A New Method of Total Nucleic Acid， Total RNA and
Total DNA Isolation from Banana Leaves
CHAI Juan1，2， FENG Renjun2， SHI Hourui1，2， REN Mengyun1，2
WANG Jingyi2 *， ZHANG Yindong1，2 *
1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
2 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience
and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（CATAS）， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract Total nucleic acid， total RNA（no DNA）and total DNA（no RNA） were isolated from banana leaves， with high polysaccharides， polyphenols and other secondary metabolites， using the method based on SDS by selectively adding suitable 5 mol/L KAc（pH4.8）and different volume of absolute alcohol. The results indicated that total nucleic could be isolated without KAc， and total RNA could be obtained with 1/3 or 2/3 volume of KAc， and total DNA could be gotten with 1/3 volume of absolute alcohol. Various nucleic acids extracted in one experiment could meet the demands of molecular biology experiment with adding the type of reagent. It is a fast and simple method.
Key words Banana leaves； Total nucleic acid； Total RNA； Total DNA； Rapid extraction
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.017
从植物组织中提取RNA和DNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。高质量的RNA是基因克隆表达、RT-PCR、cDNA文库构建等实验的原材料，高质量的基因组DNA是进行如SSR 、AFLP 等分子标记技术的基础[1]。从文献报道来看，有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA和DNA，阻碍其分子生物学方面研究的进展。香蕉（Musa paradisiaca）为大型多年生草本果树，属芭蕉科芭蕉属植物，是热带、亚热带地区最重要的水果之一。香蕉组织不仅具有坚硬的细胞壁，而且富含大量脂质、蛋白质、多糖和酚类等物质[2-5]。裂解细胞时，香蕉叶片中的酚类在多酚氧化酶作用下被氧化成醌类物质，多糖会形成难容的胶状物与RNA共沉淀下来，这些均会造成一定量 RNA的降解和丢失，从而影响到核酸的提取。因此，能否有效地去除这些干扰是提取高质量香蕉核酸成败的关键[6-7]。目前，提取植物总核酸的方法主要有异硫氰酸胍法、CTAB法、SDS 法、Trizol 法等[8-9]。王尉等[10]在SDS法的基础上改用LiCl沉淀RNA，成功提取了香蕉叶片较高质量的RNA，但提取过程耗时长、效率低；王甲水等[5]利用改良CTAB法提取香蕉根系总RNA，但提取结果不理想，出现RNA的降解情况；王暑辉等[11]利用Trizol法提取富含多糖多酚的侧柏叶片总RNA，所得RNA呈现黏稠状，经电泳检测RNA呈现粘连带型，严重降解；而Shen等[12]利用在CTAB提取液中加入二氧化硅颗粒提取板栗和银杏DNA，虽然提取结果较为理想，但提取过程复杂，成本较高。此外，上述每种方法只能提取总RNA或总DNA中的一种。随着分子生物学的发展，实验中对所需核酸质量的要求越来越高，而且类型多样，可能有的实验需要总核酸、部分实验需要总RNA、还有的需要基因组DNA，需分别提取总核酸、总RNA和基因组DNA，这样不仅费时费力，还会因多次取材对植物造成伤害，尤其对于特别珍贵的实验材料和转基因植物[13]伤害较严重。因此，本研究在SDS法的基础上经多次对核酸提取体系进行优化，探索出一种能分别快速提取植物总核酸、总RNA和总DNA的新方法。本方法前期处理简单，所需时间短，省时省力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 香蕉栽培品种为巴西蕉（Musa AAA Group），生长于中国热带农业科学院试验田，常规栽培管理。
1.1.2 器皿与耗材处理 实验所用到的玻璃器皿用锡纸包好于180 ℃烘烤8 h以上或者200 ℃烘烤4 h以上；塑料耗材预先用两层纱布包好，再侵入0.1% DEPC水中处理24 h以上，然后隔着纱布倒出DEPC水（可重复使用），121 ℃高压蒸汽灭菌40 min。
1.1.3 提取液与试剂
2 结果与分析
2.1 核酸的电泳检测分析
用上述方法提取的总核酸、总RNA、总DNA电泳检测结果见图1所示。利用改良SDS法可以提取香蕉叶片的高质量总核酸，总核酸中没有蛋白、多糖等物质的污染，并且RNA和DNA条带清晰、整齐（图1-a）。总RNA条带中有28S rRNA、18S rRNA、16S rRNA、5.8S rRNA和5S rRNA，28S rRNA条带的亮度约为18s rRNA条带的2倍，而5.8S rRNA和5S rRNA条带较弱，说明总RNA完整性较好，没有降解；其中，16S RNA可能是叶绿体的RNA[10]。而用SDS法提取的香蕉叶片总核酸条带比较模糊，其中，RNA发生严重降解，点样孔附近还有明显蛋白等杂质污染（图1-b）。
总RNA提取结果表明：用1/3 体积KAc处理（图2-1）和用2/3体积KAc处理（图2-2）都能提取高质量的总RNA，两个泳道中均无DNA、蛋白和多糖干扰，且28S rRNA、18S rRNA、16S rRNA、5.8S rRNA及5S rRNA条带清晰，纯度高，无降解，完全符合Northern杂交、cDNA合成及文库的构建等要求。而用等体积KAc处理（图2-3），RNA呈现弥散状条带，且点样孔附近有少量杂质污染，不能满足后续实验的要求。
总DNA提取结果表明：泳道中DNA条带明亮清晰，无蛋白和多糖污染（图3-1），符合PCR扩增、Southern杂交等的实验要求。1/2 体积的无水乙醇处理所提取的DNA经电泳检测条带很弱，说明RNA提取量较低（图3-2）。2/3体积的无水乙醇和等体积无水乙醇处理，几乎检测不到DNA条带（图3-3）。
2.2 核酸的紫外检测分析
所提取的总核酸、总RNA和DNA的紫外吸光值见表1所示。利用改良的SDS法所提取的总核酸，先用不含RNA酶的DNA酶消化总核酸中的DNA，然后用水饱和酚和氯仿混合试剂进行抽提1次，以去除DNA酶，得到不含有DNA的总RNA，总RNA经紫外检测其OD260/OD280在1.8～1.9 之间；所提取的总核酸用不含DNA酶的RNA酶消化总核酸中的RNA，然后用水饱和酚和氯仿混合试剂抽提一次，去除RNA酶，得到不含有RNA的总DNA，DNA经紫外检测其OD260/OD280为1.8～2.0之间，说明总核酸中的RNA和DNA均符合相关数值指标要求，二者纯度均较高。SDS法所提取的总核酸中经分离得到总RNA和DNA的方法同改良的SDS法相同，经检测其总RNA的OD260/OD280值为1.6～1.7之间；DNA的OD260/OD280比值为1.7～1.8之间，表明有多糖、蛋白等次生代谢物污染。
用改良的SDS法提取总RNA（RNA-1、RNA-2和RNA-3分别为图2中的泳道1、2、3）经紫外可见分光光度计检测其纯度，结果表明：RNA-1 和RNA-2的OD260/OD280的值均在1.8～2.0 左右，说明得到的RNA纯度较高，而RNA-3的OD260/OD280为1.5～1.7之间，表明有蛋白等次生代谢物污染。
用改良的SDS法提取的总DNA（DNA-1和DNA-2分别对应图3中的泳道1和2）用紫外可见分光光度计检测其纯度，结果表明：DNA-1的OD260/OD280均在2.0左右，符合DNA纯度检测的相关数值指标要求，说明用此法提取的DNA纯度较高；而DNA-2的OD260/OD280在2.1～2.3之间，大于2.0的指标，说明DNA发生了部分降解。
这说明本研究利用改良的SDS法，经多次优化，可以有效地去除香蕉叶片中蛋白质和多糖等杂质，所提取的总核酸（总RNA和DNA）、总RNA和总DNA的纯度较高。
2.3 RT-PCR扩增结果
对利用改良的SDS法从香蕉叶片提取到的总RNA（分别用1/3 体积和2/3体积KAc处理）以及从总核酸中分离得到的总RNA分别进行反转录，以香蕉Actin1基因为内参基因，检测RNA提取质量，结果见图4。由图4可知，从香蕉叶片中提取的RNA反转录产物中成功地克隆到大约241 bp的目标片段。说明该方法提取的香蕉总RNA具有较高的质量，能满足后续分子生物学实验的要求。
3 讨论与结论
与传统 RNA或DNA 提取方法相比较，本实验前期处理简单方便，只需要配制一套试剂，进行1次取材，可同时提取植物总核酸、总RNA和总DNA，不仅节约了时间，而且节约了提取成本。此外，实验中所用的塑料耗材先采用纱布包裹，再侵入0.1% DEPC水中处理，不仅缩短了实验人员与有毒试剂的接触时间，保证了实验人员的安全，同时减少了DEPC的挥发对环境造成的污染。从核酸的提取结果来看，本实验方法能有效抑制外源RNA酶对RNA的污染，提取的RNA和DNA的质量和纯度都较高，可以满足多种分子生物学研究的需要，具有现实意义。
利用改良SDS法提取总核酸时，匀浆上清液不用KAc进行处理，而直接采用水饱和酚和氯仿组成的混合试剂进行抽提。理论上，当用水饱和酚（pH≈5，呈酸性）进行抽提时，RNA会溶解于酸性的水相，DNA处于有机相，从而把RNA与DNA分离。但实验表明，水饱和酚只能去除少量的DNA，所以本研究采用水饱和酚提取总核酸。同时，我们选用了改良前的SDS方法做了平行试验，提取结果表明（图1和表1），改良SDS法提取香蕉叶片的总核酸效果较好。
改良SDS法提总RNA时，有效除去香蕉叶片中的酚类、多糖等杂质减少RNA的的丢失，是RNA提取成败的关键。本研究通过在匀浆上清液中分别添加不同体积的高浓度酸性醋酸钾溶液（pH值是4.8）进行处理，再通过苯酚、氯仿抽提除去多糖，得到不含DNA的RNA样品，以探索在香蕉叶片中提取高质量RNA的最佳处理条件。结果表明，在上清液添加1/3 体积至2/3体积的5 mol/L KAc（pH4.8），获得的总RNA质量较高并具有较高的转录活性。据有关文献报道，在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去多糖[15-18]，而酸性条件下有利于RNA的提取，不利于DNA的提取。所以，当加入一定量的5 mol/L KAc（pH值是4.8）并低温离心后，DNA和多糖等杂质位于管底，而上清液中只有RNA。Bahloul等[19]提取云杉组织RNA时，在匀浆上清液中加入5 mol/L KAc溶液（pH4.8）使终浓度为1.25 mol/L，获得的RNA质量得到明显改善。
提取基因组DNA时，本研究探索通过加入不同体积比（1/3体积、1/2体积、2/3体积和等体积）的无水乙醇达到有效去除RNA和多糖的目的。结果表明，当在匀浆上清液中加入1/3体积的无水乙醇进行处理时，提取得到了不含RNA和多糖等杂质干扰的DNA样品。多糖和RNA具有相似的理化性质极易形成共沉淀，所以，当添加1/3体积的无水乙醇到匀浆上清液中时，刚好多糖与RNA形成共沉淀，离心后被丢弃，得到DNA；添加2/3体积和等体积的无水乙醇到匀浆上清液中时，无水乙醇将大部分DNA、RNA和多糖都沉淀下来，上清液中几乎没有DNA，最后就只能得到少量的DNA或者得不到任何物质。徐志祥等[20]将提取得到的DNA 沉淀置于30%的乙醇中放置过夜，离心，上清液加80%的乙醇重新沉淀DNA，能有效去除多糖和其它杂质，但提取过程操作复杂，耗时较长。
综上所述，本研究在改良SDS法的基础上，通过适量添加不同体积的5 mol/L KAc和无水乙醇，对RNA、DNA的提取体系进行优化，达到同时快速提取植物总核酸、总RNA和总DNA的目的，不但获得的 RNA 质量高，纯度也好，完全可以满足进一步从事相关分子生物学研究的要求，并且整个抽提过程不足3 h，相比于CTAB法（LiCl沉淀RNA去除多糖要求4 h以上或过夜）提取RNA或DNA来说，具有快速、操作简单、获取核酸质量高等优点，可为其它多酚、多糖和多次生代谢物质 总RNA 的提取提供参考。
参考文献
[1] 张立荣， 徐大庆， 刘大群. SSR和ISSR分子标记及其在植物遗传育种研究中的应用[J]. 河北农业大学学报， 2002， 25（1）： 90-94.
[2] 张妙霞， 赖钟雄， 赵巧阳. 野生香蕉叶片总RNA提取方法研究[J]. 中国农学通报， 2009， 25（14）： 51-54.
[3] 庄军平， 苏 菁， 陈维信. 一种从香蕉果实提取高质量RNA的方法[J]. 分子植物育种， 2006， 4（1）： 143-146.
[4] 曾凡锁， 南 楠， 詹亚光. 富含多糖和次生代谢产物的白桦成熟叶中总RNA的提取[J]. 植物生理学通讯， 2007， 43（5）： 913-916.
[5] 王甲水， 张建斌， 贾彩虹， 等. 一种适合香蕉根系总RNA提取的方法[J]. 热带生物学报， 2010， 1（3）： 202-205.
[6] Kiefer E， Heller W， Ernst D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2000， 18（1）： 33-39.
[7] Salzman R A， Fujita T， Zhu-salzman K. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 1999， 17（1）： 11-17.
[8] Asif M H， Dhawan P， Nath P. A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2000， 18（2）： 109-115.
[9] 孙德权， 郭启高， 胡玉林， 等. 改良Trizol法提取香蕉叶片总RNA[J]. 广东农业科学， 2009（5）： 162-164.
[10] 王 尉， 梁国鲁， 谢江辉. 香蕉不同组织中总RNA提取方法的研究[J]. 西南师范大学学报（自然科学版）， 2007， 32（1）： 62-67.
[11] 王暑辉， 徐倩， 徐 筱， 等. 富含多糖多酚的侧柏叶片总RNA提取方法[J]. 吉林农业大学学报， 2012， 34（1）： 76-80.
[12] SHEN Y B， SHI J S. CTAB-Silica method for DNA extraction and purification from Castanea mollissima and Ginkgo biloba[J]. 中国林学， 2003， 5（3）： 10-12.
[13] 宋尚新， 肖红梅， 高 峰， 等. 转基因稻米DNA提取方法的比较研究[J]. 食品科学， 2010， 31（22）： 445-449.
[14] Bugos R C， Chiang V L， Zhang X H， et al. RNA isolation from plant tissues recalcitrant to extraction in guanidine[J]. Biotechniques， 1995， 19（5）： 734-737.
[15] 尹 慧， 陈莉， 李晓艳， 等. 百合叶片总RNA提取方法比较及优化[J]. 中国农业大学学报， 2008， 13（4）： 41-45.
[16] 淦国英， 漆艳香， 蒲金基， 等. 改良CTAB法提取高质量香蕉叶片总 RNA[J]. 广东农业科学， 2009， 7： 192-195.
[17] 李 宏， 王新力. 植物组织RNA提取的难点及对策[J]. 生物技术通报， 1999， 1（5）： 1.
[18] 阮孟斌， 李文彬， 于晓玲， 等. 一种适用于多糖多酚植物的高质量RNA快速提取方法[J]. 热带作物学报， 2011， 32（9）： 1 704-1 707.
[19] Bahloul M， Burkard G. An improved method for the isolation of total RNA from spurce tissues[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 1993， 11（3）： 212-215.
[20] 徐志祥， 程 度， 李宝健. 灰树花总DNA的制备及基因组文库的构建[J]. 遗传， 2004， 26（5）： 711-713.
责任编辑：赵军明