【摘 要】随着分子生物学的发展和应用，微生物的鉴定和分类逐渐提高到了一个新的水平。本文简要介绍了分子生物学技术在微生物鉴定和分类中的应用，包括DNA（G+C）mol%值、核酸杂交技术、核酸序列分析以及DNA分子标记技术等，以期为相关研究提供一定的理论参考。
【关键词】分子生物学技术；微生物鉴定；核酸
传统微生物鉴定和分类技术主要是依据微生物细胞形态与生活习性等进行比较从而确定其分类地位的，这些方法存在一定误差，因为即使是同一种微生物，其形态及生理生化性状等都可能存在一定的差异，很难准确鉴定。目前分子生物学技术发展迅速，通过对微生物基于核酸水平的研究，从而对其进行鉴定和分类，其简便、快速、高效、可靠的特点，是传统微生物鉴定和分类方法所达不到的，其鉴定结果更具有说服力。目前利用分子生物学技术进行微生物鉴定和分类的常用方法主要有：DNA（G+C）mol%值、核酸杂交、核酸序列分析以及DNA分子标记等。
1 DNA（G+C）mol%值
每一种微生物的DNA均有特定的（G+C）mol%值，不同微生物的（G+C）mol%值各不相同。若微生物种间亲缘关系较远，则（G+C）mol%值差别较小，反之差别较大。微生物的（G+C）mol%值一般是恒定的，不受菌龄、突变因素以及生长条件等因素的影响，所以DNA的（G+C）mol%值测定在微生物鉴定和分类中具有一定的应用价值。虽然DNA（G+C）mol%值可以作为鉴定微生物的一个重要依据，但也不是绝对的。有研究表明，具有相同或相近的DNA（G+C）mol%值的微生物并非一定就是相同或相近的种属，甚至完全不同种属的微生物也可能有相同或相近的DNA（G+C）mol%值。
2 核酸杂交技术
核酸杂交技术广泛应用于基因工程方面的研究，同时也广泛应用于微生物的鉴定和分类。目前，采用DNA-DNA核酸杂交技术在系统发生关系上进行鉴定和分类的菌株有70%以上，应用较多的技术包括DNA印迹技术、RNA印迹技术、斑点杂交技术、原位杂交技术等。核酸杂交技术发展非常迅速，目前最新的进展就是基因芯片技术。基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列，其工作原理与传统的核酸杂交技术如DNA印迹技术、RNA印迹技术杂交相一致，都是通过利用已知核酸序列与互补的靶序列进行分子杂交，然后根据杂交信号进行定性或定量分析。在微生物鉴定和分类方面，我们可以通过已知DNA片段的碱基序列，结合被标记的具有碱基互补序列的DNA或RNA片段，从而确定微生物相应的种群类别。
3 核酸序列分析
核酸序列分析的基本过程就是在核酸序列中找到基因的位置以及标记已知的DNA序列。核酸测序的主要步骤是：（1）核酸的提取纯化；（2）PCR扩增；（3）自动序列分析仪对PCR产物进行测序；（4）将序列提交到GenBank，通过BLAST程序与已知序列进行相似性分析；（5）系统发育分析，绘制系统发育树。在数据处理过程中，计算微生物属、种之间的遗传距离的方法有很多，比较常见的如Jukes-Cantor方法。在遗传距离计算完成之后，需要构建系统进化树，其方法也有很多，其中以Neighbor Join方法构建最为常见。在进行系统发育树分析时，通常用到的软件有MEGA和ARB等。
一般微生物核酸序列分析分为真菌和细菌来进行。真菌的核酸序列中，18S rDNA通常被作为测序的对象，其原因是因为其长度较长，含有更多的信息。ITS序列一般是中度保守序列，其保守性表现为种内基本相对一致，而种间的差异则比较明显。ITS序列的这种特点使得它也非常适合对属内物种间或种内差异较明显的菌群间进行系统发育分析，所以近年来ITS序列也常作为真菌的测序对象。
在细菌方面，16S rRNA序列分析已成为其种属鉴定和分类的常用方法，目前大约有2500多个种的16S rRNA序列已被报道。16S rRNA在微生物细胞中数量庞大，分子量适中，非常易于提取，且更为重要的是，16S rRNA的一级结构极其保守，所以其应用于微生物鉴定和分类中非常有用，有利于微生物之间的同源性关系的研究。一般认为，16S rRNA序列的同源性大于97%以上就可认定为属于同一个种。当然，16S rRNA寡核苷酸顺序分析并不能鉴定所有的微生物菌株，如龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，DNA同源性还不到50%，而它们的16S rRNA基因的同源性却达到99%甚至100%。
4 DNA分子标记技术
DNA分子标记技术广泛应用于遗传育种以及微生物的鉴定和分类研究中。目前，主要的分子标记技术通常可以分为三种，包括：（1）以电泳和分子杂交为核心的分子标记技术；（2）以电泳和PCR为核心的分子标记技术；（3）以 DNA序列为核心的分子标记技术。下面重点介绍几种重要的分子标记：
4.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
DNA 结构在不同物种中存在着较大的差异。同种生物的不同个体之间，尽管其蛋白质产物的结构和功能完全相同或基本相同，但其DNA 水平却可能存在着较为明显的差异。RFLP所产生的指纹图谱适用于微生物种间及种内的分型鉴定，是在种、种内以及种群水平上进行分类研究的有效手段。RFLP技术基本操作步骤是：（1）提取DNA；（2）限制性内切酶酶切；（3）凝胶电泳；（4）将固定在杂交膜DNA片段和放射性DNA探针进行Southern杂交；（5）清洗膜；（6）放射自显影。RFLP技术在进行物种多态性分析时具有较高的可靠性，不过也存在不足之处，如产生的酶切图谱通常带有较为明显的背景，使得特征酶切条带较难辨认。另外，RFLP技术对DNA的含量和纯度要求较高，且容易对环境和人体造成不良影响。
4.2 随机扩增多态性DNA（RAPD）
RAPD技术是利用随机合成的引物，通过PCR扩增靶细胞DNA。由于引物长度不同，从而会形成许多大小不一的PCR扩增产物。RAPD技术目前应用非常广泛，其基本操作步骤是：（1）样本DNA提取；（2）随机引物PCR扩增；（3）凝胶电泳；（4）EB染色或放射自显影。RAPD技术可用于微生物的种间、亚种间以及菌株间进行亲缘关系分析和菌种的鉴定和分类等。虽然RAPD技术在微生物鉴定中快速、简便，但是要想获得重复的试验结果需要严格的条件优化和标准化。另外，热循环次数、DNA聚合酶及浓度、引物和模板的比率以及镁离子浓度都可能影响RAPD指纹图谱，因此不同试验条件下的RAPD指纹图谱结果不能完全用于比较。
4.3 扩增片段长度多态性（AFLP）
扩增片段长度多态性是结合RFLP和RAPD两项技术从而形成的一种更有效的DNA指纹图谱技术，其基本操作步骤是：（1）染色体DNA的提取和纯化；（2）DNA的修饰和模板的制备；（3）AFLP反应；（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；（5）放射自显影及数据分析。AFLP可用于对各种大小不同的基因组进行指纹分析，其重复性好，分辨率高，被认为是迄今为止最有效的分子标记，当然，AFLP也有不足之处，如产生的谱带有可能发生错配与缺失等，另外其成本较高，对技术要求比较苛刻。
综上可知，微生物鉴定和分类的方法有很多，其中分子生物学技术的应用非常广泛且这些方法之间各有其优势与不足。在实际应用中，除了利用不同分子生物学技术外，要鉴定一个新的菌株，还要系统地从形态及生理生化特征等方面逐步进行鉴定，综合各项鉴定结果，才能确定菌株的分类归属。
【参考文献】
[1]Dunbar J， Ticknor L O， Kuske C R. Assessment of microbial diversity in four southwestern United States soils by16S rRNA gene terminal restriction fragment analysis [J]. Apply. Environ. Microbial， 2000，66：2943-2950.
[2]邓墨渊，王伯初，杨再昌，等.分子生物学技术在植物内生菌分类鉴定中的应用[J].氨基酸和生物资源，2006，28（3）：9-14.
[3]鲁辛辛，刘向伟，李大为.微生物基因分类鉴定的方法学进展[J].中国实验诊断学，2003，7（3）：201-206.]
[4]许云华，沈洁.DNA分子标记技术及其原理[J].连云港师范高等专科学校学报，2003，3：78-81.
[5]王晓辉，刘桂林.DNA分子标记技术[J].家畜家禽业，2003，6：50-51.
[责任编辑：汤静]