摘 要 基于毛细管液滴技术，建立了提取血液中乙型肝炎病毒（HBV）DNA的方法。方法的基本原理是向聚四氟乙烯毛细管中连续引入油相和水相溶液时，由于表面张力作用， 可以形成稳定的油包水型液滴。依次引入含有不同试样的液滴，在毛细管中完成进样、DNA结合、洗涤以及洗脱等过程。实验表明，采用蛋白酶K裂解和提高洗脱温度有利于提高DNA回收率。优化后的血清HBV DNA提取操作在25 min内完成，回收率大于60%。本方法的DNA提取量与常规方法相当，而相对标准偏差较大（23.3% vs 12.9%）。本方法具有简单、快速和低成本的优势，有望成为一种微全核酸分析系统样品前处理的有效解决方案。
关键词 微全核酸分析系统; DNA提取; 液滴; 毛细管; 乙型肝炎病毒
1 引 言
微全分析系统是将分析实验室的全部功能集成于一个微型化装置，应用于包括分子诊断、细胞分析等领域。用于核酸分析的微全系统主要包括DNA纯化、扩增与检测等功能单元。已报道的多种基于微流控芯片平台的微全核酸分析系统，显示出了微型化、集成化、低消耗以及分析快速的优势。芯片微全核酸分析系统也面临一些问题，如加工和使用成本高、控制复杂等。针对这一问题，许多研究者致力于开发低成本微型化核酸分析装置。以标准毛细管为反应器的振荡流PCR装置，为实现低成本微全核酸分析带来了希望。上述装置使用压力差或微量注射泵驱动PCR液滴在不同温度区间往复运动，实现热循环反应。这种设计减少了温度变化延迟，因而可以显著缩短反应时间。由于使用标准毛细管作为反应器，振荡流PCR装置具有明显的成本优势。这种核酸分析方法面临的问题是未能集成核酸提取与纯化，因而尚不能实现集成化核酸分析。针对该问题，本研究基于毛细管液滴技术，建立了DNA提取方法，并用于提取血液中乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）DNA。本方法利用聚四氟乙烯（PTFE）的疏水特性，在毛细管中形成油包水液滴。通过向毛细管中依次引入含有不同试样的液滴完成DNA提取及纯化。本方法有望与振荡流PCR结合，发展成为低成本微全核酸分析系统。
2 实验部分
2.1 实验装置
自行搭建的分析装置(图1a)有两个温度控制模块，每个模块从上至下分别为聚碳酸酯盖板、带有毛细管嵌合沟槽的加热铝板、Peltier加热片（北京帕尔贴公司）以及固定铝板。加热铝板表面有8个平行沟槽，嵌有聚四氟乙烯毛细管（内径1.0 mm，外径1.4 mm，江苏宏泰公司）。毛细管末端与多通道微量注射泵（保定兰格公司）连接，通过设定注射泵运行程序控制管中液滴的运动。在温控模块上方的聚碳酸酯盖板上有沟槽，用于插入磁铁。加热铝板镶嵌有PT 100温度传感器（东阳三星公司），与温控器 (日本Yamatake公司)连接，用于探测温度。计算机控制软件根据温度感应反馈信号至温控器，控制下位继电器是否输送电流至Peltier加热片。控制软件界面显示已经运行和尚未进行的注射泵运行程序，以及各个温度模块的设定与实际温度。
图1 (a)毛细管核酸提取装置结构示意图，(b)DNA提取过程示意图
Fig．1 (a) Schematic representation of experimental instrument, (b) Illustration of process of droplet-based DNA extraction in a capillary
1. 加热模块（Heating modules）; 2. PT 100温度传感器（Sensor); 3. 磁铁(Magnet)；4. 微量注射泵(Syringe pump);
5. 继电器(Relay); 6. 电源(Electric power source); 7. 温控器(Distributed multi-channel controller); 8. 计算机(Computer)。
2.2 DNA提取与纯化
毛细管中DNA提取使用磁珠提取试剂盒（杭州博日公司）。HBV阳性与阴性样品（小牛血清，美国Invitrogen公司）经荧光定量PCR分析确认。含HBV血液加入血清管，静置后获得血清。使用加热裂解提取法时，微量注射泵控制毛细管顺序吸取5
@ L矿物油，25
@ L 裂解液，2
@ L磁珠液和5
@ L血清。微量注射泵拖动上述溶液在90℃温区停留1 min后运行至30℃温区，并在该温区往复运动,完成磁珠与DNA结合。之后，液滴运行至磁铁区,将磁珠定位于该区。排出废液后引入10
@ L洗涤液，洗涤磁珠两次，最后引入10
@ L洗脱液洗脱DNA。使用蛋白酶K裂解法时，首先将10
@ L血清，10
@ L蛋白酶缓冲液与1
@ L蛋白酶K加入试管，混合后在室温下放置15 min。微量注射泵控制毛细管顺序吸入5
@ L矿物油、4
@ L结合液、2
@ L磁珠液以及10
@ L血清裂解液。随后，在毛细管中依次完成结合、洗涤和洗脱。毛细管每次使用后依次用5 mol/L HCl和纯净水各清洗1 min，再用矿物油润洗带走管壁残留水滴。使用常规方法的对照实验在微量离心管中进行，先在Mycycler PCR仪（德国Bio-Rad公司) 上进行加热裂解，之后在磁力架上完成洗涤及洗脱。
对毛细管液滴方法与常规方法提取血清HBV DNA的回收率进行比较。测试样品为用小牛血清稀释获得的一系列不同浓度标准HBV DNA溶液。使用两种方法提取的DNA均使用紫外分光光度计测定OD260/280比值，并使用HBV定量PCR试剂盒（上海科华公司）在荧光定量PCR仪(LightCycler 480，瑞士Roche公司)进行定量分析，获得HBV DNA拷贝数。DNA回收率＝洗脱液DNA拷贝数/原液DNA拷贝数×100%。提取HBV DNA的PCR产物同时在自制激光诱导荧光检测芯片电泳分析仪上分析, 分析条件参见文献\。
3 结果与讨论
3.1 毛细管中的液滴形成与运输
微液滴技术被广泛用于样品混合、运输和反应，具有体积小、效率高和反应条件稳定的优势。油包水液滴的形成需要在疏水表面实现，此时水相与油相间的表面张力小于水相与管壁间的表面张力。PTFE毛细管高度疏水特性为液滴形成和液滴反应提供了理想的条件。依次引入油相与水相溶液时，由于表面张力作用形成油包水型液滴。液滴的形成可以保持样品浓度的稳定，消除样品分子扩散和水份蒸发。为考察毛细管中液滴的稳定性，在室温条件下控制含有1 g/L FITC-BSA (北京博奥森公司) 的液滴在毛细管中连续往返运行。40个循环后液滴仍然保持完整。荧光显微镜(IX71, 日本Olympus公司)下检测未见管壁有荧光物质残留，说明由于液滴形成水相溶液与通道壁不存在直接接触。
3.2 毛细管液滴法DNA提取
文献\报道了微流控平台上结合液滴和磁珠技术的DNA提取并显示出简便、快速的优势。这类方法的局限在于需要对微流控装置进行疏水涂层，此外分析通量有限。相比之下，PTFE毛细管不仅可以为液滴操作提供理想的疏水表面，也易于实现平行化操作。毛细管液滴法提取DNA的原理是：顺序向毛细管中引入含有磁珠、样品、洗涤液和洗脱液的液滴，在液滴中完成样品-试剂混合、DNA结合、磁珠洗涤以及DNA洗脱（图1b）。在此过程中，油包水型液滴起到微阀功能，避免了因表面吸附可能造成的交叉污染；运动中液滴内部的主动混合效应可以加速DNA结合、洗涤和洗脱，起到微混合器作用；磁珠在外部磁场驱动下进入含有不同试样的液滴，为DNA结合提供固相界面。
3.2.1 裂解方式对DNA提取的影响 考察了加热裂解法和蛋白酶K裂解法。加热裂解法是在加热和使用表面活性剂及变性剂条件下，促使膜蛋白及DNA结合蛋白变性沉淀并释放出DNA。蛋白酶K裂解法则是在蛋白酶作用下，使蛋白质片段化，从而游离DNA。使用常规离心管时，加热裂解法和蛋白酶K裂解法均能高效回收DNA，相比之下蛋白酶K裂解法的回收率更高一些（图2a）。然而，在毛细管中使用高温裂解法时DNA的回收率较低，其拷贝数仅约为对照实验1/4（图2a）。对此结果的解释是，液滴在高温下不稳定，引起样品在毛细管表面吸附因而造成回收率降低。为证实这个假设，向毛细管中引入含有 1 g/L FITC-BSA的液滴，驱动其90℃条件下于毛细管中往复运动1 min，再将毛细管在荧光显微镜下拍照。结果显示，毛细管表面可见荧光物质吸附。此结果提示液滴在高温下不稳定，样品组份突破包裹油层接触并滞留在管壁，因而影响了DNA回收率。相比之下，使用蛋白酶K裂解法时所有操作在较低温度下进行，所以不存在明显表面吸附效应。当采用蛋白酶K裂解时，毛细管液滴DNA提取法的回收率得到显著改善，但与在试管中的平行操作所得结果相比, 毛细管液滴DNA提取法的回收率仍然偏低（图2a)，考虑是油-水界面对样品的捕获影响了DNA的结合效率。
3.2.2 结合与洗脱条件对DNA提取的影响 考察了结合时间以及洗脱时间、洗脱温度对DNA提取效率的影响。由图2b可见，液滴中的DNA与磁珠可以在2 min内达到最大结合量。相比之下，低浓度样品结合效率较高。2 min 结合时间条件下103拷贝/
@ L HBV DNA的回收率超过90%，而105拷贝/
@ L HBV DNA样品的回收率只能达到50%。相比传统磁珠DNA提取方法，毛细管液滴方法所需结合时间显著缩短（2 min vs 10 min）。这可能是
图2 DNA提取条件优化
Fig2 Optimization of experimental conditions for DNA extraction
a. 加热裂解和蛋白酶K裂解方法处理同一个HBV阳性血清样品所得DNA的结果，加热裂解条件为90℃，
1 min，蛋白酶K裂解条件为室温下15 min； b. 不同结合时间对HBV DNA的回收率的影响，样品经蛋白酶K裂解，DNA结合、洗涤和洗脱时间分别为 1, 2和2 min；c.不同洗脱条件下的DNA回收效率。样品经蛋白酶K裂解，DNA结合和洗涤时间分别为 1和2 min。a. Quantitations of hepatitis B virus (HBV) DNA extracted from serum samples that experienced high temperature lysis and proteinase lysis; b. Recoveries of HBV DNA with different binding time, the samples were lysed with proteinase K; c. Recoveries of HBV DNA under different elution conditions.由于微体系中分子扩散距离的缩短及液滴主动混合效应加速了DNA与磁珠的结合。
图2c显示不同洗脱条件下的HBV DNA回收率。在较低温度（30℃）下，延长洗脱时间可以提高DNA回收率。提高温度可以缩短洗脱时间，50℃ 时洗脱1 min即可接近最大洗脱量。但当洗脱温度提高至60 ℃时，DNA回收率又有所下降。这可能是因为温度升高使液滴变得不稳定，样品的表面吸附引起DNA回收量减少。在结合2 min和50 ℃ 洗脱1 min的条件下，所考察不同浓度HBV DNA样品的回收率均大于60%（图2c）。
3.2.3 毛细管液滴DNA提取方法考察 优化后的血清HBV DNA提取过程：在室温下，蛋白酶K裂解15 min，结合2 min，洗涤2 min两次，在50 ℃下洗脱1 min，整个操作在25 min内完成。使用上述操作条件处理含有103、105和107 copy/
@ L水平的HBV血清样品，并将结果与常规方法比较（表1）。两种方法提取的所有DNA样品OD260/280比值均大于1.8，提示两种方法均有效纯化了DNA。荧光定量分析结果显示，毛细管液滴方法的DNA提取量与对照方法基本相当，但相对标准偏差大于对照方法（23.3% vs 12.9%）。本实验获得的DNA提取效率与微流控核酸提取方法相当，而进样量偏差和样品在油-水界面的捕获可能是影响重现性的因素。
考察了毛细管液滴DNA提取方法的交叉污染可能性。连续3次交替处理了一个HBV拷贝数为107 copy/
@ L的阳性样品和一个HBV阴性血清样品，回收样品加入PCR体系扩增40个循环。电泳分析表明，由HBV DNA阴性血清获得的洗脱液PCR扩增结果均为阴性。说明使用此清洗方法可以有效去除毛细管表面样品残留，因此毛细管液滴DNA提取方法可用于连续样品处理。
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Droplet-based Blood Hepatitis B Virus DNA Extraction in a Capillary
LIANG Guang-Tie, WANG Qiu-Ping, WANG Wei, LIU Da-Yu, ZHOU Xiao-Mian
(Laboratory of Clinical Chemical Technology, Guangzhou First Municipal People"s Hospital,
Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510180)
Abstract A novel in-capillary droplet-based DNA extraction method was developed, using the principle of water-in-oil droplet formation in the highly hydrophobic polytetrafluoroethylene capillary. By sequentially introducing droplets containing sample or reagents, all the steps related to blood hepatitis B virus (HBV) DNA extraction, including sample injection, DNA binding, magnetic beads rinsing and DNA elution were continuously implemented in the capillary. Experimental results showed that proteinase K lysis and elevated elution temperature facilitated higher extraction efficiency. With optimized conditions, an extraction was completed in 25 min with microliter level sample/reagent consumption. The droplet-based method achieved an extraction efficiency of ～60% that is comparable to that of a commercial method. However, the RSD of extraction efficiency was relatively higher. In summary, the droplet-based DNA extraction developed is simple, fast and low-cost. It has the potential to be integrated into a micro-total nucleic acid analysis system.
Keywords Micro-total nucleic acid analysis system; Deoxyribonucleic acid extraction; Droplet; Capillary; Hepatitis B virus
(Received 13 October 2010; accepted 23 December 2010)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文