摘要： 经神州3号飞船搭载的2个紫花苜蓿品种阿尔冈金和三得利种子，种植后出现矮化植株，阿尔冈金和三得利分别选取9株和8株，利用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术对这些单株及其对照进行过氧化物酶同工酶分析，结果表明：阿尔冈金和三得利的酶谱带数为5～7条，在相对迁移率(Rf) 17.93%处，所选单株都有谱带出现，此带为2个品种的公共带；阿尔冈金和三得利过氧化物酶同工酶谱存在显著差异，可以用过氧化物酶同工酶谱分析来鉴定2个品种；所选的17个矮化单株除A8外，过氧化物酶同工酶谱与其对照相比具有显著差异，都有新增带或缺失带。
关键词： 紫花苜蓿；空间搭载；过氧化物同功酶；
中图分类号： S 551+.703文献标识码： A
文章编号： 1009-5500(2011)03-0085-04
随着人类航天事业的飞速发展，空间生命科学正日益受到科学家的重视[1-3]。空间诱变育种是通过卫星搭载植物种子，利用空间环境(如宇宙射线、粒子辐射、微重力、高速度等)对生物产生影响，引起生物的遗传物质发生变异，从而选择和培育新品种、新种质。研究表明，经空间搭载后，植物叶片的超微结构发生变化，如叶绿体解体、叶绿体周围的线粒体、高尔基体的数量增加等[4]。同功酶是基因表达的产物，从而能在最接近DNA的水平上反映植物群体的变异[5]，过氧化物酶广泛分布于植物组织，参与植物的多种生理活动，为生长发育及变异提供基因表达的灵敏指标，是一种重要的遗传标记。所以过氧化物酶同功酶分析广泛应用于种质亲缘关系鉴定，抗性鉴定，品种及杂种鉴定等方面。
紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种广泛栽培的牧草，
有着产量高、品质好等优点，素有“牧草之王”的美称[6]，在我国已有2100多年的栽培历史[7]。目前，许多优良的栽培品种，在其产业化推广过程中仍受到寒旱逆境、病虫害等因素的制约。所以，通过空间诱变育种选育具有良好性状、品质和抗性的品种是一条很好的途径。已有研究表明，空间搭载后紫花苜蓿种子发芽率[8]、株高、鲜重、单株叶片数[9]、超微形态结构和细胞核型[10]等方面都会产生明显变异。通过研究空间搭载后4个紫花苜蓿品种的多个单株的过氧化物酶同功酶酶谱，使之与未搭载酶谱进行比较，旨在探讨空间搭载对紫花苜蓿过氧化物酶同功酶的影响，利用过氧化物酶同工酶酶谱挑选变异较大的单株，为进一步进行针对性育种提供材料，也可为其他牧草的空间诱变育种工作提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
神舟3号飞船搭载的为适合甘肃省天水市种植的2个高产紫花苜蓿品种(表1)。种子由甘肃省天水绿鹏农业科技有限公司提供。
表1 紫花苜蓿品种与来源
Table 1 Alfalfa varieties and origin
编号品种学名来源
A阿尔冈金M. Sativacv.Algonguin 美国
B三得利 M. Sativacv.Sanditi荷兰
1.2 搭载处理
将精选后4个紫花苜蓿品种的种子各分为2份，将1份材料封入布袋进行搭载，另1份作地面对照(CK)，贮存于地面温湿度相近(20℃)的环境中，空间搭载返回后种植于甘肃省天水市高新技术园区，株行距为50 cm×50 cm，并按单株进行田间标记。选9株矮化阿尔冈金植株，分别标为A1～A9、8株矮化三得利植株分别标为B1～B8作为试验材料。
1.3 叶片过氧化物酶同功酶电泳
1.3.1 电泳 2个紫花苜蓿品种结实期，田间剪取各品种矮化植株同龄叶片1 g，置于预冷的研钵中，冰浴用pH 7.8的Tris-HCl缓冲液进行研磨，10 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液为酶粗提液[9]。上清液置于-20 ℃冰箱中备用。采用聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳法，凝胶交联度为2.6%， Tris-HCl缓冲体系；浓缩胶浓度为3%，pH 6.8；分离胶胶浓度8.2%，pH 8.8；电极缓冲液为pH 8.3 Tris-Gly。溴酚蓝为指示剂，进样量为6 μL。最后在稳压条件下电泳，开始100 V，3 h后加压到200V，7～8 h 结束电泳(指示剂距离胶板下边缘1 cm)。过氧化物同功酶染色用醋酸联苯胺法[12]。将胶板放在日光灯箱上，数码相机拍照。
1.3.2 分析 根据过氧化物酶同工酶电泳结果绘制酶谱示意图(图1)，依据各单株之间酶带颜色和宽窄差异，将谱带分为四级：一级酶带(色深而宽)；二级酶带(色较深而宽)；三级酶带(色较浅而窄)；四级酶带(色很浅而窄)。酶带颜色和宽窄的变化说明了过氧化物酶同工酶活性和含酶量的差异，深而宽的酶带酶活性高、含酶量高，浅而窄的酶带酶的活性低、含酶量低。计算相对迁移率。
Rf(%)=(X2/X1)×100
式中：X1为前沿指示剂迁移距离，X2为谱带中心点迁移距离。
2 结果与分析
试验材料共检测到115条过氧化物同工酶谱带，各个单株有5～7条不等的酶带，多数为5条(图1)。谱带迁移率分析表明，迁移率不同的谱带有10条，分别编号为1、2…10。其迁移率10.42%～75.41%(表2)，其中，在Rf为17.93%处，各单株都有谱带出现，这是2个品种的共有过氧化物酶带。阿尔冈金和三得利对照都出现2、3、4、6、7号带，但三得利有5号带出现，另外，4、6、7号带的颜色深浅也有差异。这说明2个品种酶谱之间存在明显差异。
2.1 阿尔冈金过氧化物酶同功酶酶谱分析
从酶谱示意图看出，阿尔冈金品种过氧化物酶同工酶谱有9条迁移率不同的谱带。阿尔冈金单株与其对照(CKA)相比，A1缺失了6、7、8号带，新增了9、10号带，而9、10号带是A1的特有带，4号带的迁移率均大于其他单株；A2缺失了6号带；A3、A7、A9的条带相似，新增5号带；A4缺失3、8号带，新增5号带；A5缺失4号带；A6缺失8号带，增加了5号带。同时，A1～A9的酶带级别均存在不同程度的差异(图1)。
2.2 三得利过氧化物酶同功酶酶谱分析
从酶谱示意图可以看出，三得利品种过氧化物酶同工酶谱有8条迁移率不同的谱带。三得利单株与其对照(CKB)相比，B1、B6条带相似，新增1号带，1号带为B1、B6的特有条带；B2、B5条带相似，缺失5号带，新增了8号带；B3、B8条带相似，缺失5号带；B4、B7新增8号带。同时，B1～B8的酶带级别存在不同差异(图1)。
3 讨论
空间环境会对植物同工酶酶谱产生影响，这在许多植物的研究中得到了证实，空间搭载后，番茄第一代幼苗的过氧化物酶比对照增加了2条，脂酶同工酶处理比对照多3条谱带[13]。对红豆草的研究也表明，空间搭载红豆草后代叶片的过氧化物同工酶酶谱较对照多1条带[14]。研究中2个紫花苜蓿品种过氧化物酶同功酶酶谱也与对照有显著差异。由于同工酶是基因表达的产物，所以这种酶谱上的差异其实是基因产生变异的结果。而且同功酶是对不同环境条件的一种适应性反应，它的存在与植物体生理生化多变性、可变性及适应性有关[15]，与植物遗传、生长发育、抗逆性等都有一定关系。特别是过氧化物酶的产生有利于自由基和丙二醛的清理，在植物抗逆性中起着重要作用[16]。所以试验各单株与对照的酶谱差异可能反映其生理生化、遗传、抗逆性等方面的变异，这些单株可作为进一步选育优良品种的材料。例如三得利B1和B6单株，相比对照新增了一条活性较高的带，而有研究表明，紫花苜蓿在低温锻炼时，出现了2条新的POD同功酶酶带且活性增加[17]，对零上低温不同抗冷力的水稻、黄瓜、龙舌兰以及马毛松的分析中，也观察到了抗冷的比冷敏的品种多出1～6条POD区带[18]。因此，B1和B6酶谱的变化可能影响其对低温的抵抗力，可作为选育抗寒性品种的试验材料。
4 结论
对照组阿尔冈金和三得利过氧化物酶同工酶谱存在显著差异，因此，可以用过氧化物酶同工酶谱分析鉴定2个品种。
在Rf为17.93%处，所选材料都有谱带出现，且均为一级条带，具有高活性，且含酶量高，此带为所选材料的公共带。
所选的17个矮化单株除A8外，过氧化物酶同工酶谱与其对照相比具有显著差异，都有新增带或缺失带，说明这些矮化单株都可能在空间搭载条件下产生过明显变异，都属于处理后的变异植株。可将这些植株作为进一步选育的试验材料，深入研究这些变异的原因和后果，从而有选择的利用这些变异，培育新的优良品种。
参考文献：
[1] 刘敏,薛淮,鹿金颖,等. 空间环境对植物试管苗生长发育及遗传变异的影响[J]. 科技导报,2004,22(6):23-25.
[2] 鹿金颖,潘毅,薛淮,等. 空间诱变番茄新品种“航遗”2号的选育[J]. 科技导报,2005,23(8):60-61.
[3] 刘敏,薛淮,潘毅,等. 地球外环境引起植物变异的研究进展[J]. 细胞生物学杂志,2003,25(3):160-163.
[4] 高文远,赵淑平,薛岚,等. 太空环境对药用植物甘草超微结构影响的初步研究[J]. 中草药,1998,29(11):770-771.
[5] Kwon S I, Anderson A J. Physiological and molecnlar plant pathology Laccase isozymes:production by an opportunistic pathogen,a Fusarium proliferatum isolate from wheat[J]. 2001,59:235-242.
[6] 李启文. 紫花苜蓿品种的品比试验[J]. 草原与草坪,2005(5):64-65.
[7] 周敏. 中国苜蓿栽培史初探[J]. 草原与草坪,2004(4):44-46.
[8] 张月学,刘杰淋,韩微波,等. 空间环境对紫花苜蓿的生物学效应[J]. 核农学报,2009,23(2):266-269.
[9] 刘存德. 空间生物学研究“空间地球人类”[M]. 南宁:广西科学技术出版社,1993:308-329.
[10] 任卫波,王蜜,陈立波,等. 卫星搭载对苜蓿种子PEG胁迫萌发及生长的影响[J]. 草地学报,2008,16(4):428-430.
[11] 任卫波,徐柱,陈立波,等. 紫花苜蓿种子卫星搭载后其根尖细胞的生物学效应[J]. 核农学报, 2008,22(5):566-568.
[12] 胡能书,万贤国. 同工酶技术及其应用[M]. 长沙:湖南科学技术出版社,1985.
[13] 李金国,刘敏,王培生,等. 空间条件对番茄诱变作用及遗传的影响[J]. 航天医学与医学工程, 2000,13(2):114-118.
[14] 徐云远,贾敬芬,牛炳韬. 空间条件对3种豆科牧草的影响[J]. 空间科学学报,1996(16):136-141.
[15] Shannon J M.Plant Isoenzymes[J]. Ann Rev Plant Physiol,1968,19:1187.
[16] 刘鸿先. 零上低温对不同抗冷力的亚热带植物过氧化物酶与酯酶同工酶的影响[J]. 植物生理学通讯,1981,7(4):337.
[17] Gerloff,E S.Soluble protein in alfalfa roots as related to cold hardiness[J]. Plant Physcol, 1967,42:895.
[18] 葛颂,王明庥. 用同工酶研究马尾松群体的遗传结构[J]. 林业科学,1988,12(1):71-84.
Effect on the peroxidase isozyme of two alfalfa varieties in spaceflight environment
ZHANG Wen-juan1,2，CHEN Ben-jian1，DENG BoD2，CHAI Xiao-qin3，ZHANG Yun-weiD2
(1. College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem，Ministry of Education/Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability/Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province,Lanzhou 730070,China; 2. Tianshui Agricultural Research Institute,Tianshui,741001,China)
Abstrac: Planted two different varieties seeds of Algonguin and Sanditi alfalfa(Medicago sativa)boarded on the spaceship of No.3 Shenzhou and then found the dwarf mutants. Selected 9 plants of Algonguin and 7 plants of Sanditi to conduct the analysis of peroxidase isoenzymes using vertical flat-sheet polyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that isoenzyme bands were from 5 to 7 and a band was detected in all strains when an Rf value was 17.93%,which are the common band of two varieties.The peroxidase isozyme zymogram of Algonguin and Sanditi have significantly differences, which can be used for two varieties identification. All selected 17 dwarf mutants except A8,there were new added band or loss band in peroxidase isozyme, which have significant differences between two varieties and their controls.
Key words: alfalfa；spaceflight；peroxidase isozyme
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”