当归挥发油对高血压模型大鼠血压及血管炎症反应的影响

对照组，其余25只大鼠第7日10：00每日灌胃L-NNA 490 mg/kg，连续28 d，于第7、14、21、28日14：00测量收缩压，每只大鼠测量3次，取平均值，以平均收缩压≥180 mm Hg为造模成功标准。停药后正常饲养5 d，14：00测定收缩压，每只大鼠测量3次，取其平均值，结果20只大鼠造模成功。

2.2 分组及给药

造模前随机选取5只Wistar大鼠作为正常组；造模后将成模大鼠按体质量、收缩压分为模型组、阳性药组、当归挥发油高剂量组（中药高剂量组）、当归挥发油低剂量组（中药低剂量组），每组5只。阳性药组每日予卡托普利药液25 mg/kg灌胃，相当于临床成人日用量的10倍；中药高剂量组每日予含当归挥发油10%当归挥发油乳剂15 mL/kg灌胃，相当于成人日用当归原药材30 g的20倍；中药低剂量组每日予含当归挥发油5%当归挥发油乳剂15 mL/kg灌胃，相当于成人日用当归原药材30 g的10倍；模型组和正常组予等容量生理盐水灌胃。每日1次，连续8周。

2.3 大鼠血压观察

用BP-98A动物无创血压测量系统测定安静状态下大鼠尾动脉收缩压，于给药第0、5、15、25、35、45、55、60日14：00测量血压，每只大鼠测量3次，取其平均值。

2.4 标本采集

第61日乙醚麻醉大鼠，腹主动脉取血10 mL，静置30 min，4000 r/min离心10 min，分离血清；取心脏组织，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.5 ELISA检测血清内皮素-1、血管细胞黏附分子-1、超敏C反应蛋白水平

按试剂盒说明设置标准品孔和样本孔，每组3个复孔，标准品稀释成5个梯度（浓度为0的标准品S0号视为空白孔），每孔50 μL；样本孔先加待测样本10 μL，后加样本稀释液40 μL；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，封板膜封住反应孔，37 ℃水浴60 min；弃液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μL，15 min内，于450 nm波长处测定各孔OD值。以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准曲线，按曲线方程计算各样本浓度值，各样本浓度×5即为样本实际浓度。

2.6 RT-PCR检测心脏组织超敏C反应蛋白基因表达

2.6.1 提取总RNA 称取心脏组织1.8 g，置于4 mL无酶EP管内，各加1.5 mL预冷PBS，用组织匀浆器匀浆；4 ℃、3000 r/min离心10 min，弃上清液；各加1 mL Trizol，混匀；转移到1.5 mL无菌管中，冰上静置5 min；各加0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，冰上静置2 min，4 ℃、13 500 r/min离心15 min，取上清液至新的离心管中；各加入等体积异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10 min，4 ℃、13 500 r/min 离心10 min，弃上清液；向沉淀中缓慢轻轻加入-20 ℃预冷的75%乙醇1 mL，小心清洗沉淀；4 ℃、13 500 r/min离心10 min；弃上清液，室温干燥5 min，各加40 μL 1‰DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度法测定总RNA，用1‰DEPC水调整总RNA至相同浓度500 ng/μL。

2.6.2 cDNA反转录 冰上配制10 μL反转录反应体系[2 μL MgCl2，2 μL 5×Reaction Buffer，1 μL PCR Nucleotide Mix，0.25 μL Oligo（dT）15 Primer，0.5 μL Go Script Reverse Transcriptase，0.25 μL Ribonuclease Inhibitor，3 μL RNase Free Water，1 μL总RNA样本]，反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、60 min；CRP反应引物、GAPDH内参基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。

2.6.3 RT-PCR扩增 冰上配制20 μL PCR反应体系[12.5 μL qPCR Master Mix，0.25 μL CxR Reference Dye，4.25 μL Nuclease-Free Water，2 μL引物，1 μL模板DNA]，反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35个循环，4 ℃保存。反应及数据采集在CFX-96系统上进行，记录CRP与内参基因GAPDH达到荧光设定值所需循环数（Ct值），每个样品中CRP的相对mRNA表达采用2-ΔΔCt法计算。

2.6.4 琼脂糖凝胶电泳 1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统分析，确认目的片段是否表达。

3 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 当归挥发油对模型大鼠血压的影响

与正常组比较，模型组大鼠收缩压明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组相关时点收缩压明显下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.2 当归挥发油对模型大鼠血清内皮素-1、血管细胞黏附分子-1及超敏C反应水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。

4.3 当归挥发油对模型大鼠心脏组织超敏C反应蛋白基因表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠心脏组织CRP mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组CRP mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表4、图1。

5 讨论

高血压是慢性血管炎症反应性疾病，血管功能障碍是高血压的重要病理特征。研究表明，在高血压发展过程中，循环系统促炎症细胞因子增多，血管炎症反应与血管功能障碍密切相关[5]。本实验结果表明，给予L-NNA后，抑制一氧化氮（NO）合成，使血管内皮收缩，增加血管张力，血压升高，持续性引起NO合成减少，则会导致血压持续升高。因此，本实验选择L-NNA建立高血压模型。

CRP触发炎症反应，可以诱导大鼠血管平滑肌细胞分泌肿瘤坏死因子-α，并且受P38MAPK-Toll样受体4（TLR4）信号通路调控。炎症因子产生增多，可以破坏内皮功能，引起收缩性因子分泌增多，同时血管内皮功能紊乱后又可活化巨噬细胞表面TLR4，进一步激活核因子-κB使炎症因子增多。因此，高血压血管内皮损伤与炎症反应相互影响。通过干预炎症反应，可以减轻炎性因子对高血压患者带来的负效应。

VCAM-1属于免疫球蛋白超家族，在炎症反应、肿瘤发展及免疫损伤时，VCAM-1表达增多，介导炎症反应[6]。

综上所述，本实验探讨当归挥发油对高血压模型大鼠血压的影响，结果显示当归挥发油可以降低血压，降低模型大鼠血清ET-1、CRP、VCAM-1的表达，RT-PCR结果显示，CRP mRNA表达给药后下调，进一步明确当归挥发油可以降低高血压炎症因子的表达，抑制血管炎症反应，这可能是其降压的潜在机制，其具体机制还有待进一步研究。

参考文献：

[1] BAUTISTA L E. Inflammation， endothelial dysfunction， and the risk of high blood pressure：epidemiologic and biological evidence[J]. Hum Hypertens，2003，17（4）：223-230.

[2] 马瑞君，王钦，陈学林，等.当归的研究进展[J].中草药，2002，33（3）：280-282.

[3] 吴国泰，高云娟，田振华，等.当归挥发油对兔离体胸主动脉平滑肌的影响[J].甘肃中医学院学报，2011，28（5）：1-3.

[4] 刘琳娜，程建峰.乙醇提取新鲜当归挥发油的抗炎镇痛作用[J].中国药房，2002，13（9）：526-527.

[5] BOMFIM G F， ECHEM C， MARTINS C B， et al. Toll-like receptor 4 inhibition reduces vascular inflammation in spontaneously hypertensive rats[J]. Life Sciences，2015，122：1-7.

[6] 陈静.清眩颗粒对高血压患者炎症反应及其诱导内皮损伤的干预效应研究[D].北京：中国中医科学院，2009.

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