摘要：构建了合浦珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ）的ｃＤＮＡ文库，并通过ＥＳＴ序列筛选和重新测序获得了一个新的Ｃ型凝集素基因的ｃＤＮＡ序列，命名为ＰｏＬＥＣ２，其长度为１ ６５９ ｂｐ，５’端非编码区为３９ ｂｐ，３’端非编码区为４５ ｂｐ，开放阅读框为１ ５７５ ｂｐ，可编码５２4个氨基酸；ＰｏＬＥＣ２蛋白的分子量约５８．０ ｋＤ，等电点为５．２；ＰｏＬＥＣ２蛋白包含一个信号肽序列（Ｍ１－Ａ１６）、一个ＭＡＭ－２结构域和一个Ｃ型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明，ＰｏＬＥＣ２与其他物种Ｃ型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在２６．５％～３３．６％，相似性在４５．１％～５５．６％。组织表达分析表明，ＰｏＬＥＣ２基因在肝胰脏、鳃、外套膜、性腺及肠组织中均有表达，经溶藻弧菌刺激后８ｈ在肠组织中的表达量显著上调。
关键词：合浦珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata）；Ｃ型凝集素；序列特征；表达分析
中图分类号：Ｓ９１７．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）19－4026-05
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃ－ｔｙｐｅ Ｌｅｃｔｉｎ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｐｅａｒｌ Ｏｙｓｔｅｒ Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata
ＨＵ Ｙｕ－ｔｉｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｄｉａｎ－ｃｈａｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｓｈｉ－ｇｕｉ１，ＳＵ Ｔｉａｎ－ｆｅｎｇ１，ＣＵＩ Ｓｈｕ－ｇｅ１，３，ＧＵＯ Ｈｕａ－ｙａｎｇ１，２，ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇ－ｑｉａｎｇ１
（１． Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３００， Ｃｈｉｎａ；
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Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅａｒｌ ｏｙｓｔｅｒ（Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata）． Ａ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｎａｍｅｄ ａｓ ＰｏＬＥＣ２， ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ using ＥＳＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ １ ６５９ ｂｐ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ １５７５ ｂｐ． Ｔｈｅ ５’-ＵＴＲ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ３９ ｂｐ ａｎｄ ３’-ＵＴＲ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ４５ ｂｐ． Ｔｈｅ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５２4 ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ５８．０ ｋＤ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ５．２． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ １６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （Ｍ１-Ａ１６）， ａ ＭＡＭ－２ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｐ． fucata ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ were ２６．５％~３３．６％ ａｎｄ ４５．１％~５５．６％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｔｉｓｓｕｅs ｏｆ Ｐ． fucata， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｆｔｅｒ ８ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata； Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｃ型凝集素为一类钙离子依赖活性的糖蛋白，具有至少一个糖识别结构域（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ，ＣＲＤ），能够识别和结合细胞膜表面的糖基，其结合糖基具有专一性，即一种凝集素只能结合一种糖基［１，２］。Ｃ型凝集素是一种模式识别受体（Ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＲＲ）蛋白，主要有Ｍａｎ型配体（Ｍａｎ－ｔｙｐｅ ｌｉｇａｎｄｓ）和Ｇａｌ型配体（Ｇａｌ－ｔｙｐｅ ｌｉｇａｎｄｓ），Man型配体与Ｄ－甘露糖、Ｄ－葡萄糖结合，Gal型配体与Ｄ－半乳糖及其衍生物结合［２］。ＰＲＲ蛋白能识别病原微生物引起宿主的免疫应答，在无脊椎动物免疫防御中发挥着重要作用［１，２］。
合浦珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ）又称马氏珠母贝，是我国海水珍珠的主要种类，由其所产的珍珠即为举世闻名的“南珠”。近年来，由于养殖技术落后、养殖环境污染和种质退化，致使养殖合浦珠母贝出现了生长缓慢、病害频发及死亡率高等现象［３］，严重影响了合浦珠母贝养殖业的发展。因此，必须加强合浦珠母贝免疫防御分子机制的研究，为其免疫防治策略的制定提供理论依据。目前在栉孔扇贝（Ｃｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉ）、海湾扇贝（Ａｒｇｏｐｅｃｔｅｎ ｉｒｒａｄｉａｎｓ）及长牡蛎（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）等［４－８］软体动物中初步开展了免疫防御分子机制的研究，发现在扇贝中存在多种Ｃ型凝集素基因，这种多样性可能与其所面临的海洋环境有关。中国水产科学研究院南海水产研究所养殖实验室近年来在合浦珠母贝免疫防御分子机制方面开展了大量研究工作，获得了多个免疫防御相关基因［９－１１］。本研究通过构建合浦珠母贝的ｃＤＮＡ文库，获得了一种新的Ｃ型凝集素基因，命名为ＰｏＬＥＣ２，通过生物信息学方法分析了其序列特征，并用实时荧光定量ＰＣＲ技术考察了其表达特征。
１材料与方法
１．１材料
合浦珠母贝来自海南省陵水县新村珍珠贝养殖基地，体长５．５～７．０ ｃｍ，置于２５～２７ ℃充气的海水中暂养１周。试验以在闭壳肌内注射１００ μＬ ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ值为６．８）的合浦珠母贝为对照组；以注射１００ μＬ溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）悬液（取过夜培养的溶藻弧菌悬浮于ＰＢＳ缓冲液中，ＯＤ６００ ｎｍ＝０．４）的合浦珠母贝为刺激组。取样时每个试验组取５～６只贝以消除个体间的差异。
１．２ｃＤＮＡ文库构建和ＥＳＴ分析
取合浦珠母贝刺激８ ｈ后的全组织于液氮下研碎，采用ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）提取总ＲＮＡ，用ＺＡＰ－ｃＤＮＡ?誖Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Kｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＺＡＰ－ｃＤＮＡ?誖Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Kｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）和PｏｌｙＡ Ttｒａｃｔ?誖ｍＲＮＡ Iｓｏｌａｔｉｏｎ Sｙｓｔｅｍ ＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等试剂盒（购自Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司）构建合浦珠母贝的ｃＤＮＡ文库。挑取克隆测序后进行ＢＬＡＳＴＸ比对，发现其中一个ＥＳＴ序列与栉孔扇贝（Ｃｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉ，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＢＢ７１６７6）的Ｃ型凝集素基因的同源性较高，挑取该阳性克隆重新测序，获得了合浦珠母贝的Ｃ型凝集素基因的cDNA序列，命名为ＰｏＬＥＣ２。
１．３序列分析
利用ＤＮＡＳｔａｒ软件查找合浦珠母贝Ｃ型凝集素cDNA序列中最大开放阅读框，用ＤＮＡＴｏｏｌ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０软件将其翻译为氨基酸序列。采用ＳｉｇｎａｌＰ ３．０［１２］软件（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＳｉｇｎａｌＰ/）对所编码的氨基酸预测信号肽，利用ＳＭＡＲＴ程序［１３，１４］（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ． ｓｍａｒｔ． ｅｍｂｌｈ ｅｉｄｅｌｂ ｅｒｇ．ｄｅ/）和Ｓｃａｎ－Ｐｒｏｓｉｔｅ 程序（ｈｔｔｐ：//ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ/）预测蛋白质结构，用Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐ：//ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ． ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ/）软件预测空间结构。用ＣＬＵＳＴＡＬＷ程序进行多序列比对后，用ＢｉｏＥｄｉｔ程序进行同源性分析，并用ＭａｔＧＡＴ ２．０１ 软件［１５］计算多序列的同源性和相似性。
１．４ＰｏＬＥＣ２基因表达分析
取未刺激的合浦珠母贝的肝胰脏、鳃、外套膜、肠和性腺用于组织表达模式分析，取溶藻弧菌刺激后０、２、４、８、１２、２４、４８、７２ ｈ合浦珠母贝的肠进行免疫应激试验。以上组织均采用ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）提取总ＲＮＡ。提取的总ＲＮＡ用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ的ＤＮａｓｅ Ｉ处理，用分光光度计定量，使参与反应的ＲＮＡ终浓度为２５ ｎｇ／μＬ，用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ ＤＲＲ０３７Ｓ）合成ｃＤＮＡ第一链，反应程序为３７ ℃ １５ ｍｉｎ，８５ ℃ ５ ｓ，反应完毕后将ｃＤＮＡ置－８０ ℃冰箱中保存备用。
根据已获得的cDNA序列设计上游引物ＰｏＬＥＣ２－Ｆ（５′－ＧＧＣＧＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧ－３′）和下游引物ＰｏＬＥＣ２－Ｒ（５′－ＣＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＣＧＡＡＧ
ＡＧＣ－３′），用β－ａｃｔｉｎ作内参，其上游引物为５′－ＧＡＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＣＣ－３′，下游引物为５′－ＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ－３’，以ｃＤＮＡ第一链为模板，进行实时荧光定量ＰＣＲ反应。反应体系总体积为２０ μＬ，包含２× ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴaＫaＲa）１０ μＬ， ｃＤＮＡ １ μＬ，正反向引物各０．４ μＬ，双蒸水８．２ μＬ，每个样品设３个平行，并用双蒸水代替ｃＤＮＡ模板作为阴性对照。反应程序为：９５ ℃预变性２ ｍｉｎ；９５ ℃变性１５ ｓ，６０ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸３０ ｓ，共４０个循环；７２ ℃延伸10 ｍｉｎ。采用ＣＴ值法（２－ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄ）［１６］和ＳＰＳＳ １３．０软件进行数据分析。
２结果与分析
２．１序列分析
获得的ＰｏＬＥＣ２序列已提交至ＧｅｎＢａｎｋ，其登陆号为ＨＱ８２７７８９。序列分析表明（图１），ＰｏＬＥＣ２ ｃＤＮＡ序列的长度为１ ６５９ ｂｐ，其中开放阅读框为
１ ５７５ ｂｐ，可编码５２４个氨基酸，５’端非编码区为３９ ｂｐ，３’端非编码区为４５ ｂｐ。ＰｏＬＥＣ２蛋白的分子量约５８．０ｋＤ，等电点为５．２。ＰｏＬＥＣ２蛋白包含一个信号肽序列（Ｍ１－Ａ１６），一个ＭＡＭ－２结构域和一个糖识别结构域（ＣＲＤ），ＣＲＤ 序列含６个保守的半胱氨酸和１个糖结合位点ＱＰＮ。
２．２结构分析
利用Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ软件预测了ＰｏＬＥＣ２、ＰｏＬＥＣ１（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ，ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：ＡＣＯ３６０４５）和栉孔扇贝Ｃ型凝集素中ＣＲＤ的空间结构（图２），这３个空间结构均由α螺旋、β折叠和线性结构构成，整个ＣＲＤ的空间结构形成一个紧凑的球形结构，３个序列的空间结构有很大的相似性，中间是β折叠片层，并形成２个反向平行结构（图２ 椭圆所示）。
２．３同源性和相似性分析
ＰｏＬＥＣ２与其他已知物种的Ｃ型凝集素基因ＣＲＤ序列经ＭａｔＧAT软件分析后，在所分析的物种中，其同源性在２６．５％～３３．６％之间，相似性在４５．１％～５５．６％之间，与栉孔扇贝相似性最高，相似性达５５．６％（表１）。序列比对结果表明，所比对的Ｃ型凝集素序列有６个保守的半胱氨酸位点，后面４个半胱氨酸两两连接形成二硫键（图３）。
２．４ＰｏＬＥＣ２基因的组织表达分析
组织表达分析结果表明，ＰｏＬＥＣ２基因在所检测的组织中均有表达，其中在肝胰脏中的表达量显著高于其他组织（Ｐ＜０．０５），在鳃、外套膜、肠和性腺中均有微量表达（图4）。经溶藻弧菌刺激后，ＰｏＬＥＣ２基因在肠中的表达分析表明，刺激后８ ｈ，刺激组表达量相对于对照组显著上调（Ｐ＜０．０１），其他时间段则无显著差异（图5）。
３讨论
本研究获得的ＰｏＬＥＣ２ ｃＤＮＡ序列的长度为
１ ６５９ ｂｐ，共编码524个氨基酸，信号肽序列为Ｍ１－Ａ１６，成熟肽中包括了一个ＭＡＭ－２结构域和一个Ｃ型凝集素的ＣＲＤ，ＣＲＤ中有６个保守的半胱氨酸，后面４个半胱氨酸形成２个二硫键［１７］。同时，ＣＲＤ中存在糖结合位点，不同的糖结合位点有不同的糖结合特性，糖结合位点一般有ＥＰＮ、ＥＰＤ、ＱＰＤ和ＱＰＮ等，前两者有甘露糖结合特性，后两者有半乳糖结合特性［１８］，本序列的糖结合位点为ＱＰＮ，具有半乳糖结合特性。此外，ＣＲＤ功能域可能与其他功能域或基序相连，ＰｏＬＥＣ２的ＣＲＤ与ＭＡＭ－２结构域相连，该功能域有粘附功能。Ｃ型凝集素基因中存在一个或几个相同的ＣＲＤ与几个不同的ＣＲＤ，而ＣＲＤ的作用是与钙离子一起介导糖基的结合［１９］。单个ＣＲＤ一般存在于比较低等生物的Ｃ型凝集素中，其他物种的Ｃ型凝集素有几个相同的或不同的ＣＲＤ［２０］，在ＰｏＬＥＣ２中只存在一个ＣＲＤ结构。ＰｏＬＥＣ２的空间结构分析结果表明，ＰｏＬＥＣ２的ＣＲＤ结构和ＰｏＬＥＣ１、栉孔扇贝的ＣＲＤ的空间结构十分相似，均形成一个紧凑的球形结构，并形成２个反向平行结构，Ｃ型凝集素结构域的空间构型是一个双环结构。一个为Ｎ－末端和Ｃ－末端的β链紧靠在一起形成了一个反平行的β片层，另一个为“长环”被包含在结构域当中［２１］。
同源性分析结果表明，ＰｏＬＥＣ２与其他已知物种的Ｃ型凝集素基因ＣＲＤ序列的同源性在２６．５％～３３．６％之间，相似性在４５．１％～５５．６％之间，其中与栉孔扇贝相似性最高为５５．６％。Ｃ型凝集素基因在不同物种间的同源性和相似性相对比较低，孙允东［２２］也指出在同一类对虾中，Ｃ型凝集素的相似性不是很高。
组织表达分析研究表明，ＰｏＬＥＣ２基因在合浦珠母贝肝胰脏中的表达水平最高，在性腺中的表达水平最低，有关文献表明，Ｃ型凝集素在贝类各个组织中的表达水平是不同的，如栉孔扇贝Ｃｆｌｅｃ－４等的Ｃ型凝集素在肝胰脏中的表达量是最高的，在其他组织中也有所表达［４－６］。肠的时序表达分析表明，刺激后８ ｈ表达量显著上调，这表明合浦珠母贝的Ｃ型凝集素可能参与了其免疫反应，在合浦珠母贝免疫防御中起重要作用。
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