![zoޛ)j馐Q4<y<$Dӯ5nDS֑4<$K yZ)M4<yF_)aOCב4OM+^nP4^]v^^[@(j{i&DS \{--y-'-ޟ<yؠzbsF'^؟ƭڝ r)7~^z v)zbzh+b|zZazzrvZh+b)](https://tp.67gu.com/showimg.php?url=http://img.resource.qikan.cn/qkimages/ankx/ankx201610/ankx20161054-2-l.jpg)
材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞与质粒。PK15细胞来自河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室；真核表达载体pEGFPC1购自北京天恩泽公司，含有目的基因E0片段的pET28aE0（BL21）菌种由郑州大学分子免疫学实验室保存。
1.1.2工具酶及试剂。质粒DNA纯化试剂盒，为TaKaRa公司产品；Lipofecta mine 2000试剂盒为invitrogen公司产品；胎牛血清和DMEM培养基，购自Gibco公司；使用的培养基为DMEM（含10%胎牛血清、链霉素、青霉素）完全培养基，加入NaHCO3调节pH至7.0 。限制性内切酶Xho1和Kpn1以及T4連接酶，均购自TaKaRa公司。
1.1.3仪器。TP214分析天平，为美国Denver公司产品； miniPROTEAN Tetra System电泳仪、GeL DocTM XR+ 凝胶成像系统，为美国BioRad公司产品；NanoDrop 2000c分光光度计、Barnstead Nanopure超纯水仪，为美国Thermo公司产品；CMAG HS4加热磁力搅拌器，为德国IKA公司产品；H1650W台式高速离心机，为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；WD9405B型水平摇床，为北京市六一仪器厂产品；透析袋MD25，为北京索莱宝科技有限公司产品；IX71倒置式荧光显微镜，为日本OLYMPUS公司产品。
1.2方法
1.2.1引物设计。根据GenBank数据库中公开发表的猪瘟病毒E0序列，利用Primer Premier 5.0设计引物扩增E0序列，预计扩增片段681 bp，设计其上下游引物：上游引物F为5′A CTCGAGCTGAAAATATAACTCAATGGAACCTGAGTGACAACG 3′的5′端含有Xho1酶切位点，下游引物R为5′A GGTACCGGCATAAGCGCCAAACCAGGTTTT 3′的5′端含有Kpn1酶切位点。
1.2.2载体构建。以提取的pET28aE0基因组DNA为模板，以F/R为引物，扩增E0基因，向50 μL体系中加入ExTaq酶25 μL、引物各0.5 μL、模板1 μL，然后加超轻水补足50 μL，PCR程序为：95 ℃变性5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，32个循环；72 ℃延伸7 min。
1.2.3重组质粒的构建。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，并用DNA纯化回收试剂盒回收纯化681 bp的 E0 基因片段，将回收片段进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带是否正确。以Xho1和Kpn1 2个限制性内切酶同时对载体和E0片段进行双酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳电泳并用DNA纯化回收试剂盒回收，用T4连接酶进行连接反应，连接条件为4 ℃过夜，将连接产物转化到E .coli DH5α感受态细胞中，在含Amp的LB培养基平板上挑取阳性单克隆，对质粒分别进行PCR鉴定、双酶切鑒定，鉴定成功后送交公司测序。并将成功构建的重组质粒命名为pEGFPE0。
1.2.4PK15细胞的转染。用质粒DNA纯化试剂盒纯化pEGFPE0质粒后供转染用。细胞重悬以后，进行细胞计数，根据12孔板底面积大小，每孔铺5×105个，铺4孔，添加DMEM完全培养基补至3 mL，过夜培养至细胞密度90%以上，DMEM不完全培养基冲洗每孔。最后，每孔加入2 mL DMEM，准备转染液，A液为240 μL DMEM﹢10 μL脂质体2000，B液为230 μL DMEM﹢20 μL（4 μg）质粒，将A液混匀后室温放置5 min后，再将A液、B液混匀，室温放置20 min。将转染液逐滴加入试验孔中，轻摇。
1.2.5G418筛选。转染6 h后观察并记录荧光情况，并将转染培养基更换为完全培养基，转染48 h后更换为G418筛选培养基，通过预试验确定G418筛选浓度为600 μg/mL。每3～5 d更换1次筛选培养基，以除去死亡细胞和细胞碎片。约21 d后在荧光倒置显微镜下观察细胞的荧光情况。
2结果与分析
2.1载体构建PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在681 bp左右的位置出现特异性片段，与预期结果一致。将此片段与真核表达载体pEGFPC1进行双酶切与连接（图1），获得了重组质粒pEGFPE0。经Xho1和Kpn1双酶切，可获得681 bp左右的特异性片段（图2）；以pEGFPE0为模板，以F/R为引物，可扩增出681 bp大小的片段（图3）。重组质粒经测序鉴定，无氨基酸突变和碱基突变，表明重组载体构建成功。
3讨论
目前应用于蛋白表达的系统大多为原核表达系统（如大肠杆菌类表达系统），大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟，但其表达产物以包涵体形式存在，因为缺乏蛋白质加工系统，所以无翻译后的加工修饰过程，其内源性蛋白酶易降解表达的蛋白质分子且细胞膜间隙含有大量的内毒素。后来，真核表达系统是最具发展前景的蛋白质产生方式，目前研究较多的是酵母和昆虫细胞表达。酵母和昆虫细胞表达存在不正确糖基化，并且还有产物复杂不易纯化、表达量较低、病毒污染等问题。据报道，单个细胞表达蛋白量达20 pg/d的工程细胞株[11]，分批补料式生物反应器悬浮培养细胞密度达2 000万/mL以上，蛋白产量高达10 g/L[12-13]。 利用猪源性的PK15细胞作为表达猪瘟病毒E0糖蛋白的表达系统，一方面是为了提高E0蛋白的表达产量，因为PK15细胞对猪瘟病毒的遗传密码子具有嗜好性。另一方面，该系统对E0蛋白的后期加工可以使得该蛋白的反应原性和免疫原性得到很大提高，为将该病毒的基因工程疫苗投入实际生产和应用奠定了基础。
重组质粒pEGFPE0稳定转染PK15细胞系时，只有部分质粒能够通过细胞质的阻碍进入到细胞核内，而最多只有80%进入细胞核内的外源DNA能够得到瞬时表达。只有极少数进入细胞的外援基因在通过一系列非同源分子间重组和连接后整合到细胞染色体中，细胞基因组的自由部分进行表达。此外，在此整合的过程中，并不一定所有整合到细胞染色体的外源基因都能够表达，因为整合的区段是不同的。只有整合到了表达区段的基因才能够表达，所以要筛选出能够稳定表达外源基因的转染体，筛选的依据为共转染的编码抗生素的抗性基因所提供的新表型。
G418是稳定转染常用的筛选试剂，它是一种氨基糖类抗生素，其结构与庆大霉素、新霉素、卡那霉素相似，它能够阻断蛋白质的合成，因此对原核和真核细胞都具有不同的毒性 ，其中包括细菌、植物、酵母、哺乳动物细胞以及一些原生动物和蠕虫。但是，当pEGFPC1载体所携带的neo抗性基因被整合到细胞基因组正确的位置后，它能够启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而使得neo抗性产物——氨基糖苷磷酸转移酶高效表达，进而将G418转变成无毒形式，使得细胞获得足够的抗性，并且能够在含有G418的筛选培养基中生长。连续使用筛选培养基筛选14～21 d，在此过程中要及时更换培养基，去除死亡细胞的细胞碎片，以免死细胞产生的有害物质影响正常细胞的生长。约21 d后，就能够得到稳定表达外源基因的细胞克隆，将此克隆用胰酶消化至培养板中继续传代培养，并收集表达的重组蛋白。
由于PK15细胞本身没有绿色荧光蛋白基因，将PEGFP和猪瘟病毒E0基因的编码区相连得到的重组基因可以用来研究基因的表达情况和活细胞内外源基因表达蛋白质的定位。笔者成功地表达了PEGFPE0融合蛋白，为进一步大量表达和纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。
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