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GmvhySX97i{iX对照）及克隆转化子验证是否连接上同源片段CaFIG1.L。琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3B，将正确的转化子命名为pWC1。
在质粒pWC1的基础上用同样的方法连接同源片段CaFIG1.R，同理，用引物FIG1.R.F和引物FIG1.R.R通过PCR扩增出带有Pst I，BamH I这2个酶切位点的同源臂CaFIG1.R（图3A）。用Pst I和Bam H I同时双酶切质粒pWC1及同源片段CaFIG1.R，酶切产物纯化后，将两者按照一定比例进行连接，并转化大肠杆菌感受态。对获得转化子提质粒后，用Pst I/BamH I双酶切验证质粒p5921（作为负对照）及克隆转化子验证是否连接上同源片段CaFIG1.R。琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3C，将正确的转化子命名为pWC。
最后，用Sac I/Pst I线性化敲除盒质粒pWC，即获得了待转化用的URA3敲除盒。电泳检测结果见图3D。
2.3 CaFIG1基因第一拷贝的敲除与鉴定
以实验室已有的野生型菌株RM1000为背景，敲除CaFIG1基因。用HIS1敲除组件敲除CaFIG1基因的第一拷贝。采用醋酸锂方法[14]，将4 ug CaFIG1基因敲除组件HIS1转化白念珠菌RM1000细胞，取适量转化菌液涂布于SD.His固体培养基上，30 ℃，培养2～3 d至单菌落出现。将获得的单菌落在SD.His固体培养基纯化后，接单菌落于3 ml SD.His液体培养基中30 ℃振荡培养过夜，收集细胞，提取基因组验证。以基因组为模板，用FIG1.DF和HIS1.DR及FIG1.DR和HIS1.DF这2对引物，退火温度均为53 ℃，延伸时间1.5 min，验证CaFIG1基因第一拷贝的敲除。正确敲除掉CaFIG1基因第一拷贝的菌株命名为WYCA.1，用10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4。
2.4 CaFIG1基因第二拷贝的敲除与鉴定
在敲除掉CaFIG1基因第一拷贝的基础上，用URA3敲除盒敲除CaFIG1基因的第二拷贝。采用醋酸锂方法[14]，将4 μg URA3敲除盒转化白念珠菌WYCA.1细胞，取适量转化菌液涂布于SD.Ura-His固体培养基上，30 ℃，培养2～3 d至单菌落出现。将获得的单菌落在SD.Ura.His固体培养基纯化后，接单菌落于3 ml SD.Ura.His液体培养基中30 ℃振荡培养过夜，收集细胞，提取基因组验证。以基因组为模板，首先用FIG1.ORF.UP和FIG1.ORF.DOWN验证CaFIG1基因的ORF是否还存在，在CaFIG1基因ORF不存在的基础上，用FIG1.DF和HisG.DR及FIG1.DR和HisG.DF这2对引物验证，退火温度均为53 ℃，延伸时间1.5 min。将正确敲除掉CaFIG1基因第二拷贝但带有Ura+标记的菌株命名为WYCA.2。PCR产物经10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5。
最后需要通过hisG片段重组去除URA3基因，选取WYCA.2菌株的转化子涂布于5.FOA平板上，培养3～5 d后长出单菌落。得到单菌落后，再挑取这些单菌落，分别划线于含有0.1%5.氟乳清酸的YPD平板及YPD平板上进行纯化，在30 ℃培养箱中培养2～3 d长出单菌落。能在YPD平板上生长但在含有0.1% 5.氟乳清酸的YPD平板上不生长的单菌落，可能利用了2个hisG片段的顺势重组除去了URA3基因。然后将其接种于YPD液体培养基中，过夜培养，提取基因组，进行PCR验证。以基因组为模板，FIG1.DF和 HisG.DR及FIG1.DR和HisG.DF这2对引物验证，退火温度均为53 ℃，延伸时间均为1.5 min。用10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图6。
3 结论与讨论
该研究采用2种不同的敲除策略，在RM1000背景下成功构建了白念珠菌CaFIG1双等位基因缺失株，为CaFIG1基因功能的研究奠定了基础。首先，以PCR为基础的基因敲除技术，构建HIS1敲除盒，敲除白念珠菌CaFIG1基因的一个拷贝。其次，通过克隆的手段，将CaFIG1基因的2个同源片段，分别连接到载体质粒 p5921的hisG.URA3.hisG两侧相应酶切位点，构建了可以重复利用的敲除盒质粒pWC。将其线性化后获得了URA3敲除盒，用于敲除CaFIG1基因的另一个拷贝。
与传统的基因敲除方法相比，使用2种不同的敲除策略，通过2个筛选标记，降低了在敲除基因第二拷贝时敲除盒替换第一拷贝的概率，实现目的基因的准确敲除。且依据基因的同源重组效率主要依赖于基因敲除组件提供的同源区域片段大小[15]，通过用长引物进行PCR扩增可以获得较长侧翼同源区域序列的敲除盒，有效地提高了同源重组的效率。这种基因敲除的策略为基因的敲除提供了一种新的思路与方法。
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