LOX—1受体启动子基因调控及其抗大鼠肾脏损害的作用

材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠50只，体重160～200 g。以数字法将大鼠随机分为五组，每组10只。五组大鼠在体重及其他方面比较，差异无统计学意义（P>0.01），具有可比性。A组：普通饲料，未用PIP。B组：高脂饲料（含3%胆固醇+10%猪油），未用PIP。C组：高脂饲料，PIP干预组，C1组按10 µg/（kg·d）静脉注射；C2组按5 µg/（kg·d）静脉注射。D组：高脂饲料，他汀干预组，瑞舒伐他汀5 mg/（kg·d）灌胃给药。治疗时间均为8周。

1.2 检测方法

1.2.1 标本留取 实验期间，每两周采用套尾法测量血压，以及代谢笼采集24 h尿液各一次。血浆和肾脏标本在苯巴比妥麻醉状态下采集，其中肾组织首先行生理盐水灌注冲洗，然后切片放入10%福尔马林（pH 7.4）固定，石蜡包埋，用于组织学检查。剩余肾组织放入液氮冷冻或-80 ℃深低温冰箱保存。

1.2.2 Real-time PCR 提取总RNA，合成cDNA文库，通过Real-time PCR检测肾皮质LOX-1 mRNA表达水平，以及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表达水平。

1.2.3 血液生化学及尿液检测 试验结束前，取血测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。测定24 h尿蛋白定量、血尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）水平。测定血浆钠离子（Na+）、钾离子（K+）和醛固酮水平。

1.2.4 组织PIP含量分析 取肝、肾、肺、心脏及脂肪组织，制成匀浆，化学方法粗提PIP，高效液相色谱分析PIP。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计量资料以（x±s）表示，比较采用F检验，计数资料比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PIP对大鼠肾组织LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA表达水平的影响 B组大鼠肾组织LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA水平均较A组明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。C1组、C2组及D组大鼠肾组织LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA水平较B组低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2 PIP对大鼠血脂水平的影响 B组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量均较A组明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01），而HDL-C水平较A组降低，差异有统计学意义（P<0.01）。C1组、C2组大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平与B组比较无明显差异（P>0.05）。见表2。

2.3 PIP对大鼠24 h尿蛋白定量、血BUN及Scr水平的影响 B组大鼠24 h尿蛋白定量较A组明显升高（P<0.01）。C1组、C2组及D组大鼠24 h尿蛋白定量较B组均明显降低（P<0.01）。C1组、C2组大鼠血BUN、Scr水平与A组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 PIP对大鼠血浆Na+、K+及醛固酮水平的影响 C1组、C2组、D组大鼠Na+、K+及醛固酮水平与A组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨论

脂质代谢紊乱是造成肾脏损伤的独立危险因素。动物实验研究显示[4-5]，高胆固醇饮食使肾脏疾病恶化。氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）被认为与肾脏疾病的进展密切相关[6]。血浆LDL水平升高时，由于氧自由基及其代谢产物的作用，使LDL发生氧化成为OX-LDL。OX-LDL可活化内皮细胞和系膜细胞等，导致内皮通透性增加、内皮功能损伤，促进细胞因子和生长因子分泌，最终导致细胞损伤[7-8]。

LOX-1是一种单链跨膜蛋白，属C型选择素家族。LOX-1除了分布于内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞外，还分布在肾小球内皮细胞、肾小球系膜细胞及肾组织间隙细胞等。LOX-1是OX-LDL的膜受体，通过与OX-LDL特异性结合介导肾脏损伤的病理过程，包括诱导黏附因子和炎症因子表达、加剧局部炎症等作用[9-13]。本研究结果显示，高脂血症大鼠肾组织中LOX-1 mRNA表达水平明显升高，表明在高脂血症的病理状态下，大鼠肾组织LOX-1表达水平显著上调，参与介导肾脏损伤过程。

吡咯-咪唑聚酰胺（PIP）是一种新型的小分子化合物，它能不借助载体进入细胞核，特异性结合于相关启动子基因的DNA序列中，阻止基因启动子序列与相应的转录因子结合，而从源头上抑制目的基因的表达。目前已经合成了多种特异性PIP，用于冠心病、动脉粥样硬化、肾病等疾病的实验研究[3，14-15]。本研究应用针对LOX-1的PIP进行干预，结果显示，针对LOX-1的PIP可显著抑制高脂血症大鼠肾组织LOX-1 mRNA表达，表明针对LOX-1的PIP能明显下调肾组织LOX-1受体启动子基因的活性，起到有效调控LOX-1基因表达的目的。

本研究结果显示，高脂饮食组大鼠24 h尿蛋白定量较普通饮食组明显升高，表明高脂组大鼠肾功能下降，存在肾脏损伤。应用针对LOX-1的PIP干预后，可显著减少高脂组大鼠24h尿蛋白定量，提示针对LOX-1的PIP能有效减轻肾脏损害，保护肾功能。

综上所述，合成的PIP化合物能明显下调高脂血症大鼠肾组织LOX-1 mRNA表达，改善肾功能及抑制肾脏损害，具有一定的肾脏保护作用。

参考文献

[1] Kasiske B L，O’Donnell M P，Schmitz P G，et al.Renal injury of diet-induced hypercholesterolemia in rats[J].Kidney Int，1990，37（3）：880-891.

[2] Roh D D，Kamanna V S，Kirschenbaum M A，et al.Oxidative modification of low-density lipoprotein enhances mesangial cell protein synthesis and gene expression of extracellular matrix proteins[J].Am J Nephrol，1998，18 （4）：344-350.

[3] Yao E H，Fukuda N，Ueno T，et al.Novel gene silencer pyrrole-imidazole polyamide targeting lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 attenuates restenosis of the artery after injury[J].Hypertension，2008，52（1）：86-92.

[4] Steinmetz O M，Panzer U，Stahl R A，et al.Statin therapy in patients with chronic kidney disease：to use or not to use[J].Eur J Clin Invest，2006，36（8）：519-527.

[5]王捷，邵延坤，田宇，等.阿托伐他汀对动脉粥样硬化形成及脂蛋白受体表达的影响[J].中华实验外科杂志，2014，31（12）：2717-2719.

[6]廖江铨，杜金行.氧化低密度脂蛋白对大鼠肾脏系膜细胞增殖及LOX-1、TNF-α表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2014，15（4）：306-309.

[7]陈亚锋，江洪，龚霞，等.消退素E1对氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中华心血管病杂志，2011，39（11）：1039-1043.

[8]牛娜，孙书珍，韩波，等.OX-LDL/LOX-1与高脂肥胖幼鼠血管内皮功能障碍的相关性及烟酸的干预效果[J].中华医学杂志，2013，93（42）：3388-3393.

[9]刘华，李航，陶建翎，等.白细胞介素1β通过植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1途径促进人肾小球系膜细胞摄取氧化低密度脂蛋白[J].中华肾脏病杂志，2010，26（7）：520-524.

[10] Stancel N，Chen C C，Ke L Y，et al.Interplay between CRP，atherogenic LDL，and LOX-1 and its potential role in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Clin Chem，2015，1（25）：1-3.

[11]陈洁，缪静，周鑫斌，等.丹蒌片对动脉粥样硬化大鼠血管内皮功能及LOX-1表达的影响[J].心电与循环，2015，34（6）：425-428.

[12]蔡欣蕊，钱卫斌，钱秋海，等.糖肾宁对糖尿病肾病大鼠早期肾功能及LOX-1 mRNA表达的影响[J].中国药师，2014，17（5）：709-712.

[13] Thakkar S，Wang X，Khaidakov M，et al.Structure-based design targeted at LOX-1，a receptor for oxidized low-density lipoprotein[J].Sci Rep，2015，18（5）：16 740-16 742.

[14] Matsuda H， Fukuda N， Ueno T， et al.Development of gene silencing pyrrole-imidazole polyamide targeting the TGF-beta1 promoter for treatment of progressive renal diseases[J].J Am Soc Nephrol，2006，17（2）：422-432.

[15] Matsuda H，Fukuda N，Ueno T，et al.Transcriptional inhibition of progressive renal disease by gene silencing pyrrole-imidazole polyamide targeting of the transforming growth factor-β1 promoter[J].Kidney Int，2011，79（1）：46-56.

（收稿日期：2016-02-22） （本文编辑：蔡元元）

推荐访问:抗大 受体 肾脏 基因 调控