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[摘要]为了解3种姜黄色素（姜黄色素、一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素）体外抗血管生成作用。该研究检测了3种姜黄色素对OX-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的抑制作用;对HUVEC细胞迁移的影响;鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法观察姜黄色素对血管生成作用;RT-PCR检测HUVEC细胞生长因子VEGF的表达;RT-PCR检测HUVEC细胞黏附因子ICAM-1，VCAM-1的影响。结果发现3种姜黄色素在4，8，16mg·L-1剂量范围内，对OX-LDL诱导的HUVEC细胞增殖都有抑制作用，且抑制效果呈剂量依赖关系。姜黄素对HUVEC细胞增殖的作用大于其他2个衍生物（P<0.01）。3种姜黄色素都能抑制HUVEC细胞的迁移、抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成。中，高剂量姜黄素的迁移抑制率大于一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素（P<0.01）。3种姜黄色素都能下调VEGF，ICAM-1的表达，对VEGF下调作用姜黄素比一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素明显（P<0.01）;二脱甲氧基姜黄素对ICAM-1的下调作用最明显（P<0.01）;三者对VCAM-1的表达作用不明显，二脱甲氧基姜黄素有下调作用（P<0.05）。该研究显示3种姜黄素均有抗血管生成作用，抑制内皮细胞增殖和迁移，下调内皮细胞生长因子VEGF和黏附分子ICAM-1的表达可能是其作用的机制。
[关键词]姜黄色素;迁移;抗血管生成;VEGF;ICAM-1
Study on anti-angiogenesis effect of three curcumin pigments
and expression of their relevant factors
HUANG Yan-fen， ZHU Xue-xin， DING Zhi-shan， LV Gui-yuan*
（Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）
[Abstact] To study the in vitro anti-angiogenesis effect of three curcumin pigments（curcumin， demethoxycurcumin， bisdemethoxycurcumin）. In the study， the inhibitory effect of the three curcumin pigments on proliferation of HUVEC cells induced by OX-LDL and the effect on migration of HUVEC cells were detected. The effect on neovascularization was observed by chorioallantoic membrane（CAM） test. The effect on cell adhesion factors ICAM-1 and VCAM-1 of HUVECs were tested by Real-time RT-PCR. It was found that the three curcumins could inhibit the proliferation of HUVEC cells induced by OX-LDL within the dosage range 4， 8， 16 mg·L-1， with a dose-dependence. The proliferative effect of curcumins on HUVECs was greater than the other two derivatives （P<0.01）. All of the three curcumin pigments inhibited the migration of HUVEC cells and the angiogenesis of chick chorioallantoic membrane （CAM）. The migration inhibition rate of curcumins at middle and high concentrations was greater than the other two （P<0.01）. All of the three curcumin could down-regulate the expression of VEGF and ICAM-1， and curcumins showed more obvious effect in down-regulating VEGF than demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin（P<0.01）; Bisdemethoxycurcumin showed the most significant effect in down-regulating ICAM-1（P<0.01）. All of the three showed no remarkable effect on expression of VCAM-1， and only bisdemethoxycurcumin showed the down-regulating effect（P<0.05）. According to the findings， all of the three curcumin pigments could resist angiogenesis by inhibiting proliferation and migration of endothelial cells and down-regulating the expression of VEGF and adhesion molecules ICAM-1.
[Key words]curcumins; angiogenesis; migration; VEGF; ICAM-1
doi：10.4268/cjcmm20150230
姜黄色素是从中药姜黄根茎中提取的一种酚性色素，包括姜黄素、一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素。从结构看，三者均有相同的基本母核，不同点是一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素比姜黄素分别少1，2个甲氧基。姜黄素的药理实验报道的较多，其对多种肿瘤具有明显的抑制作用[1-2]、抗肿瘤细胞转移[3]作用等。对姜黄素的2个天然衍生物一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素的作用研究报道很少。
本研究从抗OX-LDL诱导内皮细胞增殖、抗迁移、抑制鸡胚血管生成以及对血管内皮生长因子、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）与血管细胞黏附分子（VCAM-1）的表达方面比较这3种姜黄色素的抗血管生成作用。
1材料
姜黄素、一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素（本实验室提取分离，纯度90%以上）;VEGF逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（大连宝生物工程有限公司）;VEGF上游：5′-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3′，下游：5′-CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC-3′（547bp）;GAPDH上游：5′-ACCTGAACCTGCCGTCTAGAA-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′（247bp）;VCAM上游：5′-ACAGGGCTCAGGGTCAG-3′，下游：5′-GTTCCAGCGAGGGTCTA-3′;ICAM上游：5′-TCCAGGGAACAGACCAC-3′，下游：5′-CAAGAAGATAGCCAACCAA-3′;GAPDH上游：5′-CCCACGGCAAGTTCAACGGCA-3′，GAPDH下游：5′-TGGCAGGTTTCTCCAGGCGGGC-3′，引物由上海生物工程公司合成。
8500-H型双束紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）;Tanon4100数码凝胶图像处理系统（上海天能）;Bio-Rad基因扩增仪（美国伯乐）;荧光定量PCR仪（美国伯乐公司Bio-RadIQ5）。
2方法
2.13种姜黄色素对OX-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的影响人脐静脉内皮细胞HUVEC1.5×104个/mL接种于96孔培养板，每孔200μL，用含10%FBS的DMEM培养液37℃，5%CO2孵育24h，随机分组：空白对照组、OX-LDL组、OX-LDL加不同浓度的3种姜黄色素。分别加生理盐水、不同浓度OX-LDL、先加OX-LDL处理再加不同浓度的3种姜黄色素培养。48h后进行MTT检测。计算其对HUVEC增殖的抑制率，抑制率=（药物组吸光度-对照组吸光度）/对照组吸光度×100%。
2.23种姜黄色素对人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移的影响参照Trochon[4]介绍的方法，将琼脂糖在平皿上制成胶，并切去其中的2/3，将消化好的内皮细胞接种在切去胶的部分，培养3d后待内皮细胞长满单层后，刮去另一部分胶，并同时加入含有不同浓度的姜黄素、一脱甲氧基姜黄素和二脱甲氧基姜黄素的培养基，质量浓度分别为4，8，16mg·L-1，每个剂量组4块平板，继续培养48h后取出培养物，甲醛固定，染色后，显微摄影记录结果，计数迁移细胞数，计算迁移抑制率，抑制率=（对照组细胞数-实验组细胞数）/对照组细胞数×100%。
2.33种姜黄色素对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的影响80只受精种蛋，重量约（50±2）g，60%湿度，（37.8±0.5）℃孵育1周后，孵育第7天消毒蛋壳，照蛋灯下寻找胎头，在胎头右下方约0.5cm处划2cm×3cm区域，揭去蛋壳，暴露出卵壳膜。用眼科镊轻敲卵壳膜，此时CAM膜下陷，形成假气室（区别于自身的气室）。用透明胶带纸封帖假气室，形成透明观察窗。
孵育第8天揭掉透明胶带纸，随机分为生理盐水对照组、姜黄素、一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素低、中、高剂量组，质量浓度分别为4，8，16mg·L-1每组8个种蛋。将分别载有生理盐水、3种姜黄色素的无菌微孔滤膜（直径5mm）放置在相对应的种蛋观察窗的CAM膜表面的血管最多处，用透明胶带纸封闭卵壳开口，继续置于培养箱中孵化，3d后，撕开胶带纸，在观察窗加入甲醇-丙酮（1∶1）固定液，取下CAM，剪成以微孔滤膜为中心半径约为9mm圆，放入盛有少量水并铺有滤纸的平面皿里展开，阴干，连同滤纸保存。用扫描仪扫成图像，计数微孔滤膜周围5mm内大中小血管数目，并摄影记录。
2.4RT-PCR检测HUVEC细胞生长因子VEGF的表达将生长良好的HUVEC细胞1×106个/mL接种于培养瓶中，每瓶5mL，培养24h后加药，设空白对照组：用含10%灭活新生牛血清的RPIM1640完全培养液培养，姜黄素、一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素各16mg·L-1，培养24h后提取总RNA。
紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，纯度要求为A260/A280>1.8，提取的总RNA进行cDNA合成。
cDNA合成：10μLRNA，加入1μLOligo（dT）18混匀，70℃温育5min，立即置冰浴中冷却至少1min依次加入5×RTbuffer5.0μL，20U·μL-1RNase抑制剂1.0μL，10mmol·L-1dNTP混和物2.0μL，37℃温育5min，加20U·μL-1逆转录酶M-MuLV1μL，体系共20μL，42℃保温60min，70℃保温10min后结束反应，4℃放置。
PCR扩增反应：10×缓冲液5.0μL，25mmol·L-1MgCl24.0μL，25mmol·L-1dNTP1.0μL，VEGF上下游引物各2.0μL，5U·μL-1Taq酶0.5μL，2.0μLcDNA作为模板进行扩增，双蒸水33.5μL反应体系50μL进行扩增。95℃预变性10min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环后于72℃延伸7min，产物取5μL进行电泳。用数码凝胶图像处理系统对电泳条带扫描，用Image-Proplus5.0软件进行定量分析。
2.5Real-timePCR检测3种姜黄色素对HUVEC细胞黏附因子ICAM，VCAM的影响将HUVEC细胞经不同浓度的3种姜黄色素处理24h后按TRIzolReagent说明书提取总RNA，溶解于DEPC处理水中。取1μg总RNA，在20μL体系中以Oligo（dT）18为引物，用AMV逆转录酶合成第一链cDNA。
荧光PCR扩增反应：ddH2O8μL，2×SYBRPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA1μL，反应体系为20μL。进行荧光定量PCR扩增，反应条件为94℃预变性3min;94℃变性30s;50～55℃退火30s;72℃延伸30s，循环40次;72℃延伸3min。每个样品重复3次。每一个样品的的Ct值，以空白对照组为对照，以GAPDH为内参，计算ICAM，VCAM目标基因的相对表达量2-ΔΔCt。ΔΔCt=（待测组目的基因平均Ct-待测组内参基因平均Ct）-（对照组目的基因平均Ct-对照组内参基因平均Ct）。
2.6统计分析统计学分析应用SPSS17统计软件。计量资料以表示，二组间比较用t检验，方差齐性时以LSD方法，方差不齐时以Dunnett"方法分析。
3结果
3.13种姜黄色素对OX-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的抑制作用OX-LDL能促进HUVEC细胞增殖，当质量浓度为16mg·L-1时，差异非常显著（P<0.01）。3种姜黄色素都能抑制OX-LDL诱导的HUVEC增殖，成浓度依赖性。姜黄素抑制作用比一脱甲氧基姜黄素和二脱甲氧基姜黄素抑制作用强（P<0.01），一脱甲氧基姜黄素和二脱甲氧基姜黄素抑制作用无显著差异，见表1。
3.23种姜黄色素对HUVEC细胞迁移抑制率的影响经4，8，16mg·L-13种姜黄色素处理48h后，HUVEC细胞的迁移数明显减少，迁移抑制率随着药物浓度的增加而明显升高，差异显著（P<0.01）。在中，高剂量时，姜黄素组的迁移抑制率大于一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素，见表2，图1。
3.33种姜黄色素对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成作用正常CAM血管呈树枝状、叶脉样生长。生理盐水组CAM呈轻度辐射状、放射状生长，血管分支、密度适中。与生理盐水组比较，3种姜黄色素都有抑制血管生成作用（P<0.01，P<0.05）。其中姜黄素中、高剂量组血管分支明显减少，密度降低明显（P<0.05），比一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素3个剂量组都有明显抑制血管生成作用（P<0.01，P<0.05）。低剂量组差异不显著;对大血管抑制作用差异不显著，见表3，图2。
3.4RT-PCR法检测VEGFmRNA的表达空白组、姜黄素组、一脱甲氧基姜黄素组及二脱甲氧基姜黄素组VEGFmRNA的表达分别是（0.407±0.032），（0.268±0.056），（0.381±0.052），（0.395±0.065），各组与空白对照组比较，3种姜黄色素作用后，VEGF的表达表达量降低，差异显著（P<0.05），且姜黄素的降低作用更显著，与一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素差异显著（P<0.01），见图3。
3.5Real-timePCR检测HUVEC细胞黏附分子ICAM-1，VCAM-1的表达在16mg·L-1时，3种姜黄色素都能下调HUVEC细胞ICAM-1的表达，其中
（VEC）的激活、细胞外基质（ECM）的降解、VEC的移行、增殖、毛细血管样管腔结构的形成及血管外膜的形成[5]，血管新生与退化与多种细胞因子、生长因子及其受体间相互作用的结果，其中血管内皮生长因子（VEGF）是起重要作用的细胞因子之一[6-7]。在血管新生过程中，VEGF与其他细胞因子协同，通过促进内皮细胞增殖、迁移、管结构的形成及细胞外蛋白的水解，进而完成血管的新生过程。血管生成与肿瘤、慢性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化等病理过程密切相关[8-9]。
有资料显示，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）与血管生成有关，在某些疾病过程中的血管生成及发生发展过程中起着重要作用[10]。巨噬细胞能够释放一系列血管生成因子包括血管内皮生长因子（VEGF）及血管细胞黏附分子（VCAM-1）[11]。肿瘤中浸润的巨噬细胞与血管生成因子相互作用，能够促进肿瘤的生长，与血管生成有关。
利用血管形成抑制剂治疗肿瘤已成为其治疗的一个新途径和手段，目前研究、应用的有抑制干扰血管内皮细胞生长的药物：如血管抑素（An～giostatin）、抑制成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），血管内皮生长因子（VEGF）的药物SU5416、抗VEGF抗体，干扰血管内皮细胞附着、迁移如抗整合素（Integrin）抗体等。
大量实验研究证实，中药能够抑制肿瘤新生血管的生成，重楼醇提物能够抑制肿瘤新血管生成[12]，独活水提物能抑制鸡胚尿囊膜血管生成[13]，合欢皮有抑制血管生成作用[14]，莪术中的β-榄香烯能直接抑制VEGF介导的血管生成作用[15]。姜黄素、一脱甲氧基姜黄素和二脱甲氧基姜黄素是中药姜黄的3种主要色素，混称姜黄色素，Mohan等[16]采用兔和小鼠角膜小囊实验观察了姜黄色素对角膜血管生成的影响，结果发现，姜黄色素可明显抑制血管生成。本实验发现，3种姜黄色素都能明显抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖和迁移，姜黄素抑制作用比一脱甲氧基姜黄素和二脱甲氧基姜黄素抑制作用强，这和前期实验对牛主动脉平滑肌（VSMC）增殖的抑制作用一致。迁移实验发现，姜黄素组的迁移抑制率大于一脱甲氧基姜黄素、二脱甲氧基姜黄素。3种药物间有差异。在鸡胚绒毛尿囊膜实验中，3种姜黄色素都有抑制血管生成作用，姜黄素的抑制作用最明显。但是之前研究3种姜黄色素对体外人肝癌细胞HepG2生长作用中发现，二脱甲氧基姜黄素抑制增殖作用比姜黄素和一脱甲氧基姜黄素强。姜黄色素对内皮细胞增殖的抑制作用具有细胞种类特异性。本研究提示，对肿瘤的血管形成及转移进行药理干预可以作为姜黄素及其衍生物抗肿瘤的靶点。
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[责任编辑张燕]