【摘 要】目的：观察活血通络方对白细胞介素-1β（IL-1β）刺激类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞（HFLS）增殖和miR-155以及相关细胞因子分泌的影响。方法：HFLS-RA培养到第4代至第8代。经IL-1β诱导后给予含药血清，采用MTT法检测空白组、模型组、对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组含药血清对HFLS-RA增殖的影响，荧光定量PCR法检测miR-155及相关细胞因子表达。结果：MTT法测定HFLS-RA增殖活性的结果显示，模型组比正常组细胞数量明显增多（P < 0.01），对照组和高、中剂量组增殖活性明显降低（P < 0.01），低剂量组未表现出对HFLS-RA增殖有显著影响。对照组及低、中、高剂量组miR-155、IL-2、IFN-γ和RANKL相对表达水平均低于模型组，IL-4、IL-10相对表达水平高于模型组（P < 0.05）。高剂量组miR-155、IL-2、IFN-γ和RANKL相对表达水平均低于对照组，IL-4、IL-10相对表达水平高于对照组（P < 0.05），中剂量组miR-155、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和RANKL相对表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：活血通络方抑制HFLS-RA增殖，其治疗RA可能通过下调miR-155表达抑制RA滑膜成纤维细胞中IL-2、IFN-γ和RANKL等细胞因子表达，提高IL-4、IL-10等细胞因子表达相关。
【关键词】 关节炎，类风湿;活血通络方;miR-155;细胞因子;细胞实验;大鼠
类风湿关节炎（rhumatoid arthritis，RA）是一种以慢性关节滑膜炎症和骨破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病。RA发病机制主要是T细胞介导的免疫反应异常[1]。miR-155在单核巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞、B细胞等各种免疫细胞表面广泛表达，发挥免疫调节效应，与炎症、自身免疫病及肿瘤关系密切[2]。有研究显示，miR-155在RA患者的滑膜和滑液巨噬细胞及外周血单核细胞中高表达，在临床和实验性关节炎中发挥促炎作用[3]。ALIVERNINI等[4]也详细阐述了miR-155在RA中驱动免疫系统异常激活，以及作为疾病生物标志物和治疗靶点的潜力。中医学认为，RA属“络病”范畴，活血通络法可改善RA炎症症状，控制病情进展[5]。本研究观察活血通络方对RA滑膜成纤维细胞（HFLS-RA）增殖和miR-155及相关细胞因子表达的影响，探讨其治疗RA的可能机制。
1 实验材料
1.1 实验细胞及动物 HFLS-RA购于广州吉妮欧生物科技有限公司，常规培养于37 ℃培养箱，每2～3天换液1次，并及时观察细胞状态。健康清洁级雌性Wistar大鼠48只，体质量200～250 g。由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（京）2011-0004。
1.2 实验药物 活血通络方，由张锡纯《医学衷中参西录》活络效灵丹加味组成，药物组成：当归20 g、丹参20 g、乳香10 g、没药10 g、生黄芪30 g、鸡血藤30 g（此为成人每日剂量）。购于北京同仁堂，并由北京中医药大学中药学院中药鉴定教研室鉴定，使用前全部药材经煎煮、过滤，水浴蒸发至其高、中、低剂量每毫升药液分别含生药材2.58 g、1.29 g、0.645 g。雷公藤多苷片（浙江得恩德制药有限公司，生产批号1507120B，规格10 mg），具有抗炎及免疫抑制作用，用量8.75 mg·kg-1·d-1。
1.3 实验试剂 RPMI-1640培养基、遗传霉素G418、青链霉素双抗、胎牛血清（美国Gibco公司）;超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green PCR Mixture、DnaseⅠ（康为世纪生物科技有限公司）。miR-155、白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-10、γ-干扰素（IFN-γ）、核转录因子-κB（NF-κB）和RANKL等基因引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列见表1。
2 方 法
2.1 含药血清的制备 将48只健康Wistar大鼠适应
性饲养1周后，随机分为5组，空白组、对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，空白组16只，其余每组8只。空白组给予蒸餾水灌服，其余组分别给予相应药物，给药剂量同1.2。将每日剂量分2次给药，2次间隔6 h以上，连续灌胃7 d，末次给药前12 h开始禁食不禁水。结束给药1 h后，水合氯醛麻醉，无菌条件下由腹主动脉取血，静置1 h后离心机以3000 r·min-1离心15 min取上清，将同组血清混合，于56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤器过滤除菌，分装置于-80 ℃保存备用。
2.2 细胞分组 将HFLS-RA常规培养于含2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 U·mL-1青霉素和80 U·mL-1链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱内培养。将细胞培养分为正常组（HFLS-RA + 空白组含药血清）、模型组（HFLS-RA + IL-1β诱导 + 空白组含药血清）、对照组（HFLS-RA + IL-1β诱导 + 对照组含药血清）、低剂量组（HFLS-RA + IL-1β诱导 + 低剂量组含药血清）、中剂量组（HFLS-RA + IL-1β诱导+中剂量组含药血清）和高剂量组（HFLS-RA + IL-1β诱导 + 高剂量组含药血清）。
2.3 HFLS-RA增殖检测 采用MTT法检测各组含药血清对HFLS-RA增殖的影响。取对数生长期细胞，以5×104·mL-1细胞接种于96孔培养板。培养24 h后按2.2分组分别加入相应的含药血清培养基，每组设5个复孔，继续培养24 h后吸弃培养基，加MTT溶液100 μL，孵育4 h后终止培养，吸去上清，每孔加入DMSO 150 μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。振荡摇匀后，于酶联免疫检测仪490 nm处测定各孔吸光度值（OD值）。设正常组细胞增殖活力为100%，按公式计算各组对HFLS-RA增殖的相对抑制率，实验重复3次。
2.4 荧光定量PCR法检测miR-155及相关细胞因子表达 各组细胞在37 ℃、5%CO2条件下培养72 h后收集成纤维细胞培养上清液，离心取上清。提取上清液中总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA提取情况。反转录获取miR-155、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和RANKL等基因的cDNA。采用SYBR Green PCR Mixture，以cDNA為模板进行荧光定量PCR检测，检测仪器为LineGene-3310荧光定量PCR仪。采用2-△△ct方法进行数据的相对定量分析，以GADPH为参比，其中ΔΔCt = （Ct目的基因-CtGADPH）实验组-（Ct目的基因-CtGADPH）对照组。
2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析，结合Post Hoc Multiple Comparison的LSD与SNK检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 MTT法检测各组含药血清对HFLS-RA增殖的影响 在倒置显微镜下观察可见，常规条件培养下正常组HFLS-RA呈梭形或菱形，细胞状态较为良好，经IL-1β（10 μg·L-1）诱导后细胞相同传代时间下其形态无变化，但密度明显增加，分裂速度加快。与模型组（即经IL-1β诱导后）比较，加入含药血清作用24 h后细胞数量明显减少，部分细胞形态呈现不规则状，表现为突触回缩，并出现细胞碎片。MTT法测定HFLS-RA增殖活性的结果显示，模型组比正常组细胞数量明显增多（P < 0.01），而对照组和中剂量组、高剂量组增殖活性明显降低（P < 0.01），低剂量组未表现出对HFLS-RA增殖有显著影响。相对抑制率高剂量组的效果最为显著，优于对照组，但差异无统计学意义（P > 0.01）。见表2。
3.2 活血通络方对RA滑膜成纤维细胞miR-155及相关细胞因子表达的影响 对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组miR-155、IL-2、IFN-γ和RANKL相对表达水平均显著低于模型组，IL-4、IL-10相对表达水平显著高于模型组（P < 0.05）。高剂量组miR-155、IL-2、IFN-γ和RANKL相对表达水平均显著低于对照组，IL-4、IL-10相对表达水平显著高于对照组（P < 0.05）;中剂量组miR-155、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和RANKL相对表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。
4 讨 论
RA是以滑膜炎症为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病，目前尚不完全清楚滑膜炎症的调控机制。但已有研究显示miRNA可作为基因转录后水平的调控因子对RA滑膜炎症进行调节。其中miR-155与免疫调控的关系最为密切，于萍等[6]研究结果表明，与骨关节炎HFLS比较，HFLS-RA中miR-155呈高表达，并通过下调靶标ILBKE mRNA抑制基质金属蛋白酶-3的表达，进而改变滑膜局部炎症环境，促进RA形成。“络病”理论由来已久，RA是“新病入络”学说的代表性疾病，临床上从络辨治痹证一般以活血化瘀通络法为常用治则。化瘀通络法可改善RA炎症症状，控制病情进展。在临床工作中，活血通络方对改善RA患者临床症状和相关炎性指标、血液流变学等有一定的作用，该中药复方对RA的改善作用可能与影响滑膜炎症相关[7]。
目前对NF-κB受体活化因子配体/骨保护素（RANKL/OPG）系统在RA中的作用研究较为透彻，与RA患者局部关节、软骨和骨破坏具有重要关系。研究显示，RANKL主要生物活性是促进破骨细胞和前体细胞分化、成熟和活化，阻止破骨细胞凋亡，RANKL活性越高，表示破骨细胞介导的骨破坏越严重[8]。同时RA将骨降解和炎症两个过程紧密结合在一起，RA患者处于慢性炎症之中，这种慢性炎症又能导致关节软骨和骨破坏，既与破骨细胞大量形成密切相关，也会造成骨形成和骨吸收发生失衡。
IL-2又称为T细胞生长因子，主要通过作用于多种T细胞，产生免疫增强作用，RA患者通常表现为IL-2异常升高。IL-4可降低IL-1和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达和分泌，降低关节软骨的破坏;同时抑制IL-6和IL-8的分泌，体外培养RA滑膜细胞中，IL-4与IL-10都具有抑制IL-1和TNF-α表达的作用，IL-4及其受体对Th17引发的炎性反应具有调节作用，而Th17在RA发病中起核心作用。IL-4还促进Th细胞向Th2型细胞分化，与IFN-γ等Th1型细胞因子具有拮抗作用。IFN-γ可活化巨噬细胞，增强主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ类抗原的表达，增强自然杀伤细胞活性，并具有抑制纤维母细胞产生胶原，促进炎症反应的作用，IFN-γ水平升高与关节炎发病具有密切相关性[9-10]。
雷公藤是治疗RA的常用中药，现代研究显示，雷公藤多苷能够降低佐剂性关节炎大鼠血清和关节腔中IL-6和TNF-α水平，并提高IL-10水平实现抑制滑膜腔组织增生和血管翳的形成[11]。彭桉平等[12]研究显示，雷公藤内酯醇可通过下调miR-155表达，释放含巯基肌醇磷酸酯酶1，进而抑制脂多糖诱导的RA患者的单核细胞炎症反应。活络效灵丹是中医常用的治疗痛症的方剂，方中丹参、乳香和没药具有活血化瘀、通络止痛之效，配合当归养血活血，土茯苓、山慈菇祛湿消肿。本研究比较了活血通络方与雷公藤多苷对miR-155及细胞因子的影响，结果显示，不同剂量活血通络方均能影响HFLS-RA中miR-155及多种细胞因子水平，且高剂量降低幅度最大。
综上，活血通络方可能通过下调miR-155表达抑制HFLS-RA中IL-2、IFN-γ和RANKL等细胞因子表达，促进IL-4、IL-10等表达。但本研究未涉及miR-155调控细胞因子表达的分子机制研究，可通过设计miR-155基因敲除实验探究其调节细胞因子表达的可能机制。
5 参考文献
[1] 何宏军，寇静鑫，王玲，等.联合云克治疗类风湿关节炎的中远期疗效观察[J].风湿病与关节炎，2016，5（11）：15-18.
[2] 馮佳，夏燕，陈安平，等.类风湿关节炎患者外周血miR-146a及miR-155的表达及临床意义[J].风湿病与关节炎，2016，5（10）：8-11.
[3] SPOERL D，DUROUX-RICHARD I，LOUIS-PLENCE P，et al.The role of miR-155 in regulatory T cells and rheumatoid arthritis[J].Clin Immunol，2013，148（1）：56-65.
[4] ALIVERNINI S，GREMESE E，MCSHARRY C，et al.MicroRNA-155-at the critical interface of innate and adaptive immunity in arthritis[J].Front Immunol，2017（8）：1932.
[5] 丁德经，周学平.辨病与辨证相结合治疗类风湿性关节炎[J].中华中医药杂志，2016，31（12）：5058-5061.
[6] 于萍，龙丽，王世瑶，等.MiR-155在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及功能研究[J].中华风湿病学杂志，2010，14（7）：460-463.
[7] 靖卫霞，朱跃兰.浅析活络效灵丹治疗类风湿关节炎瘀证[J].湖南中医药大学学报，2017，37（4）：395-397.
[8] GEUSENS PP，LANDEWÉ RB，GARNERO P，et al.The ratio of circulating osteoprotegerin to RANKL in early rheumatoid arthritis predicts later joint destruction[J].Arthritis Rheum，2006，54（6）：1772-1777.
[9] 张良，白人骁.细胞因子与类风湿性关节炎治疗新进展[J].中国医药导报，2008，5（11）：27-29.
[10] 施晓柯.类风湿性关节炎相关细胞因子的研究进展[J].中山大学研究生学刊：自然科学与医学版，2012，33（4）：1-5.
[11] 王玉明，张秦.雷公藤多甙片在类风湿关节炎中的应用体会[J].风湿病与关节炎，2013，2（7）：60-61.
[12] 彭桉平，黄宪章，刘瑞萍，等.雷公藤内酯醇调控miR-155抑制类风湿性关节炎患者单核细胞促炎反应[J].细胞与分子免疫学杂志，2014，30（6）：635-638.