摘要：骨形态发生蛋白9（BMP-9）是转化生长因子超家族的成员之一，已知BMP家族中成骨活性最强的成员；Smad蛋白在其信号传导中起重要作用；BMP-9腺病毒为载体表现出强大成骨能力；BMP-9还具有促进原始神经元乙酰胆碱的合成，调节造血干细胞，降低血糖等作用。
关键词：骨形态发生蛋白9；信号通路；成骨作用；腺病毒
骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，简称BMPs）是转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成员之一，在人体内由肝脏合成并分泌，具有多种生物学功能，尤其是骨诱导能力，现已成为了医学界的研究热点，特别是为难以突破的骨缺损修复问题提供了新的治疗方法，现阶段BMP家族中的BMP-2和BMP-7以被成功应用到临床治疗中，并取得了良好的效果。BMP-9又称GDF2（growth differentiation factor 2），是已知BMP家族中成骨活性最强的成员，因其骨诱导活性不会受到免疫反应的较大抑制，故也是该家族中唯一能在有免疫能力的活体动物体内显著诱导骨形成的成员。目前研究已证实，动物模型中BMP-9可有效地修复骨缺损。现阶段BMP-9 的成骨机制、成骨作用、表达纯化方法、载体及支架材料的选择已经成为目前研究工作的热点和重点。
1基本特征
BMP9（也称GDF-2，growth differentiation factor 2）是BMPs 中的一种，主要由肝脏分泌并完成表达，其免疫原性较低，通常不会引起免疫排斥反应，只具有轻微的免疫刺激能力。BMP9从结构上看为高度保守的糖蛋白，对核酸酶以及胶原酶等大部分蛋白酶不敏感，只对胰蛋白酶和糜蛋白酶敏感。现已经证实BMP9具有诱导和维持胚胎神经元的类胆碱分化、调节葡萄糖和脂肪酸代谢、调节体内铁的动态平衡等多种重要功能，BMP-9通常会以前体和二聚体的形式存在，其在结构上不含有第7保守半胱氨酸这一特点与绝大多数TGF-β超家族成员相区别[1-2]。人BMP-9的基因位于染色体10q1 1.22，它的前体蛋白包含428个氨基酸残基，该氨基酸序列中有50%-55%与BMP-2，4，5，6，7，8相同，人与鼠的BMP-9有80%的同源性[3-4]。
2信号传导通路
2.1 Smad蛋白 现有的研究已经确认Smad蛋白在TGF-β超家族成员的信号转导中具有重要的作用。TGF-β超家族的二聚配体与细胞膜表面的Ⅱ和Ⅰ型丝氨酸 /苏氨酸激酶受体结合形成异四聚复合体。活化后的Ⅰ型受体使R-Smad磷酸化 ，磷酸化的R -Smad与Co-Smad形成异聚复合体，进入细胞核与其它转录协同子和抑制子共同调节靶基因的转录。且不同的Smad介导不同的TGF-β家族成员的信号转导。到目前为止，已经从哺乳动物体内分离和鉴定出8种Smad蛋白，按功能分为3类：即受体活化型（或称通路限制型）、共同通路型和抑制型。其中、受体活化型具有介导BMPs通路的作用；共同通路型通过与细胞核内的特异蛋白一起结合到细胞的DNA上调控靶基因的转录；抑制型通过与Ⅰ型受体结合而抑制BMPs配体的活性[5-7]。
2.2依赖 Smads 信号传导通路与非依赖Smads 信号传导通路 在BMPs信号传导通路的过程中，异源二聚体受体与BMPs配体结合后，Ⅱ型受体的转磷酸作用使Ⅰ型受体在丝氨酸/甘氨酸区被磷酸化，从而激活Ⅰ型受体，Smad 1、Smad 5、Smad 8 羧基端上的丝氨酸序列会在其丝氨酸激酶的作用下磷酸化从而将信号传入至细胞内。接下来两个或者两个受体调控的Smad蛋白分子与一个Smad 4会形成一个异源性三聚体或着形成一个异源二聚体进入到细胞核内，核转录因子与核内Smads蛋白的MH2区域进行结合，作用于目的基因[8-9]。
MAPK信号传导通路是目前研究最多的非依赖Smads 信号传导通路。MAPK是一种苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，主要有细胞外相关信号蛋白激酶（ERK），两个应激活性蛋白激酶（JNK），以及p38 MAPK三种类型[10]。它参与细胞的增殖分化、不同种细胞间的相互作用、细胞的恶变。Gresser WA等人的研究表明以上三种蛋白激酶都能提高成骨分化能力[11]。
2.3 BMP-9成骨信号传导通路 现有研究表明经典Wnt 信号通路、Hey1、碱性螺旋-环-螺旋蛋白和过氧化物酶增殖体活化受体2、激活素受体样激酶1 和2、胰岛素生长因子2 及类维生素A 等都与BMP-9的骨诱导过程有关。BMP-9在结构上有别于TGF-β超家族的其他成员，其型号传导通路也有所不同。KangQ等人研究表明，具有成骨作用的BMP-2/6/7，在受到骨形成的负性调节因子的BMP-3的作用时，骨形成能力受到较大的抑制，然而对BMP-9却不能发挥作用[12]。HepG2肝肿瘤细胞能大量表达BMP-9的两种高亲和性受体（约为54 kD和80 kD），但这两种受体却不能与BMP 3，5，6结合，而仅与BMP-2，4 在有限的程度内结合[13]。这些研究都表明BMP-9存在与TGF-β超家族的其他成员不同的受体，也有可能存在新的信号传导通路。此外胰岛素生长因子2，类维生素A也与BMP-9发挥作用密切相关。
3 BMP-9与骨形成
3.1 BMP-9与腺病毒 BMP-9的成骨作用须与良好的载体结合，在生物体内发挥作用。以腺病毒为载体的BMP-9表现出了强大的正位和异位骨诱导活性。在BMPs诱导脊柱融合的实验中，将Ad-BMP-9和Ad-BMP-2经脊柱旁肌肉组织直接注射后证实有明显的骨质沉积作用，使脊柱融合。Ad-BMP-9诱导椎旁肌肉组织骨发生的作用比Ad-BMP-2更强[14]。Cheng等的研究发现以腺病毒为载体的14种人BMP（BMP2-15），作用于成骨细胞祖细胞C3H10T1/2和C2C12后，BMP9、2、6三组骨钙素的表达明显，细胞内矿化结节的形成最为显著，此外在成骨细胞系的培养过程中加入BMP9、2、6重组腺病毒后，碱性磷酸酶（ALP）显著表达，这表明BMP-9以及BMP2，6 具有较强的骨诱导能力[15]。Li 等将5种重组人BMP（rhBMP）腺病毒转染的C2C12细胞，植入无胸腺裸鼠和SD大鼠体内，在相同剂量下测得Ad-BMP-9组ALP活性最高。裸鼠中新骨形成平均体积Ad-BMP-9仅次于Ad-BMP-6，4，而SD大鼠内Ad-BMP-9在较BMP-6低100倍的剂量下就能诱导更多的骨，其他则无骨形成16。这表明Ad-BMP-9在SD大鼠中的成骨活性最强，同时也提示BMP-9信号途径可能不受宿主免疫反应的明显限制。Abdelaal 等将BMP-9以腺病毒为载体注人裸鼠背阔肌中，连续3 w每周行肌肉组织活检，第3 w后出现X型胶原、骨桥素（OPN）等软骨和骨标志物，明显触摸到肌肉内骨组织[17]。
3.2 BMP-9与其他载体 甘强等人以真核质粒为载体成功构建表达质粒pcDNA4/His Max-BMP-9，但真核表达系统纯化出的 rhBMP-9 的骨诱导活性不及rhBMP-218。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是属于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细胞，还μ具有分化为肌细胞、软骨细胞、基质细胞、肝细胞等多种细胞的能力。江等人研究表明BMP-9基因修饰的骨髓间充质干细胞MSCs成骨能力较单纯MSCs明显增强[19]。Bessa等从细菌克隆中得到人BMP-9cDNA全长序列，通过PCR 扩增、质粒重组、转染得到表达BMP-9蛋白的大肠杆菌。LB培养基中培养转染后的大肠杆菌、离心、收集上清液（包含溶解的重组人BMP-9），运用带His 标签的层析柱和脱盐柱过滤上清液，得到纯化率95%的BMP-9，并证明了其具有较高生物活性[20]。此外、天然生物材料包括胶原（collagen）、脱钙骨基质（demi-neralized bone matrix，DBM）、藻酸盐（alginate）、透明质酸、壳聚糖等； 人工合成高分子材料聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）也都纳入了研究范围。
4 BMP-9的其他生物学作用
在神经系统中BMP-9促进胚胎鼠原始神经元的乙酰胆碱（ACh）的合成，可诱导胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱小泡转运体的表达。BMP-9 与成纤维细胞生长因子（ bFGF） 在神经系统的发育中起协同作用，BMP-9保持种族特异性，而bFGF保持原始细胞特性的一致性[21]。
BMP-9 在调节造血干细胞的生长中有双向作用，高浓度的BMP9对造血干细胞的生长有抑制作用，低浓度的BMP9则产生促进作用。Lopez-CoviellaI的研究报告表明，用无血清培养基时，BMP9的浓度达到100 μg/ml可以完全抑制体外克隆的造血祖细胞集落形成单位（CFU-C）增长的效应，反之，当BMP-9的浓度为3 μg/ml是可产生促进增长效应[22]。
实验数据显示，为糖尿病大鼠单一注射BMP-9 就可使血糖降低并接近正常水平。对大鼠监测发现BMP-9可能通过促进胰腺β细胞释放胰岛素、调节肌肉中的糖原合成激酶及抑制肝糖产生降低血糖[23]。BMP-9 能提高脂代谢关键酶的表达，促进苹果酸酶和脂肪酸合酶的合成，在调节肝脂肪酸合成过程中有重要作用[24]。
5展望
BMP-9骨诱导作用的研究已取得一定进展，在动物模型中已成功地进行骨缺损修复和脊柱融合的基因治疗。现有的研究也已证明其是BMPs家族中成骨能力最强的成员，但BMP-9的基本结构、诱导骨形成的机制以及载体的选择等问题尚不完全明确，随着研究的深人，BMP9必将有着广阔的临床应用前景。
参考文献：
[1]Groeneveld EH， Burger EH. Bone morphogenetic proteins in human bone regeneration [J]. Eur J Endocrinol， 2000，12（1）：9-21.
[2]SieberC ，S chwaerzer GK ，K naus P. BoneMorphogenetic Proteins：From Local to Systemic Therapeutics；article[J].BMP signaling is fine tuned on multiple levels.VoⅪ.hardcover ed：Birkha user，2008.
[3]Little SC ，Mullins MC. Bone morphogenetic protein heterodimers assemble heteromeric type I receptor complexes to pattern the dorsoventral axis[J].Nat Cell Biol，2009，11：637-633.
[4]Celeste Al， Song JJ， Cox K， et al[J].J Bone IVfiner Res， 1994，9（Suppl 1）：S13.
[5]Wrana J L. Regulation of Smad activity[J]. cell， 2000，100（2）： 189-192.
[6]Zhang F，QiuT Wu X ， et a1.Sustained BMP signaling in osteoblasts stimulates bone formation by promoting angiogenesis and osteoblast differentiation[J].J BoneMiner Res，2009，24：1224-1233.
[7]Inoue Y Imamura T. Fteguiation of TGF-beta family signaling by E3 ubiquitin ligases[J]. Cancer Sci，2008，99： 2107-2112.
[8]Massague J， Seoane J， Wotton D. Smad transcription factors[J].Genes Dev，2005，19：278-810.
[9]MoustakasA， Souchelnytskyi S， Heldin GH. Small regulation in TGF-psignaling transduction [J]. J Gell Sci， 2001，114（24）：4359-4369.
[10]Lai GF， Gheng S L. Signal transductions induced by bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta in normal human osteoblastic cells[J].J Biol Chem，2002，277：15514-22.
[11]Grass erW A， Gr1ic I， Borovecki F， et al. BMP-6 exerts its osteoinductive effect through activation ofIF-I and EF pathways[J]. Inter }rthopae， 2007，31（6）：759-765.
[12]Kang Q， Sun MH， Cheng H， et al[J].Gene The，2004； 11（17）：1312-132.
[13]Song JJ， Celeste Al， Kong FM， et al[J].Endocrinology， 1995，136（10）：4293-429.
[14]Alden TD， Beres EJ， Laurent JS， et al[J].J Cranicfac Surg， 2000，11（1）：24-30.
[15]ChengH ，Ji angW ，P hilipsF M，et al [J].J Bone Joint SurgA m，2003，85（8）：1544-1552.
[16]Li JZ， Li H Sasaki T， et al. Gene Tier， 2003，10（20）：1735-174
[17]Abdelaal MM， Tbolpady SS， Kessler JD， et al[J].J Craniofac Surg，2004，15（5）：736-744.
[18]甘强，胡侦明.真核表达重组骨形态发生蛋白9的纯化及生物骨诱导活性分析[J].生物医学工程学杂志，2013，30（4）：822-827.
[19]江标，李明.人骨形成蛋白9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞异位成骨实验研究[J].四川大学学报（医学版），2008，39（5）：723-727.
[20]Bessa PC， Cerqueira MT， Rada T， et al. Expression， purificationand osteogenic bioactivity of recombinant human BMP-4， -9， -10，-11 and -14[J].Protein Expr Purif，2009，63（2）：89-94.
[21]Miller AF，Harvey SA，Thies RS，et al. Bone morphogeneticprotein-9. An autocrine / paracine cytokine in the liver[J].J Biol Chem，2000，275（24）：17 937-17945.
[22]Lopez-Coviella I，Berse B，Thies RS，et al. Upregulationof acetylcholine synthesis by bone morphogenetic protein 9in a murine septal cell line[J].J Physiol Paris，2002，96（1-2）：53-59.
[23]Lopez-Coviella I，Berse B，Krauss R，et al. Induction andmaintenance of the neuronal cholinergic phenotype in thecentral nervous system by BMP-9[J].Science，2000，289（5477）：313-316.
[24]Ploemacher RE，Engels LJ，Mayer AE，et al. Bone morphogeneticprotein 9 is a potent synergistic factor for murinehemopoietic progenitor cell generation and colony formationin serum-free cultures[J].Leukemia，1999，13（3）：428.
编辑/肖慧