新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

材料与方法

1.1 试验材料

植物表达载体pCAMBIA1304、大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105、限制性内切酶SacⅠ和NcoⅠ、T4DNA连接酶、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、引物等。

1.2 试验方法

1.2.1 MvNHX1启动子目的片段获得 以含有目的片段的pEASY-T1- pMvNHX1质粒为模板，使用上游引物NS1（5’-CGAGCTCTTGGAAGCTGGCATGGAG

GATG-3’）和下游引物NA1（5’-CATGCCATGGGG

CAATGGGCACTGATGACTGG-3’）扩增得到带有SacⅠ和NcoⅠ双酶切位点的启动子片段，回收并纯化。

1.2.2 植物表达载体pMvNHX1：GUS构建 将植物表达载体pCAMBIA1304用SacⅠ和NcoⅠ双酶切，去除CaMV35S启动子片段。酶切后获得的MvNHX1启动子目的片段与酶切后的植物表达载体pCAMBI

A1304进行连接反应，反应体系为25 μL（10×T4 Buffer为2.5 μL，MvNHX1启动子目的片段为6 μL，pCAMBIA1304目的片段为5 μL，T4 DNA连接酶为1 μL，加水至25 μL），16℃反应25 h。将连接后的植物表达载体pMvNHX1：GUS转化到大肠杆菌中，涂抹于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，参照全式金质粒小提试剂盒说明书进行质粒DNA提取。使用菌液PCR和双酶切鉴定构建出的新的植物表达载体。

1.2.3 植物表达载体pMvNHX1：GUS转入农杆菌 首先活化农杆菌EHA105至其OD600约为0.6，制备农杆菌感受态细胞，然后将重组质粒pMvNHX1：：GUS转入进感受态细胞中，接种于YEB固体平板上（含50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平），28℃培养24 h，待平板长出单菌落后挑取摇菌，进行菌液PCR和双酶切鉴定。

2 结果与分析

2.1 植物表达载体的构建

用核酸内切酶NcoⅠ和SacⅠ分别双酶切pCAMBIA1304质粒和阳性重组质粒pEASY-T1-

simple-pMvNHX1。然后回收目的片段，将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌Trans-T1，通过画板，卡那霉素筛选后挑单菌落，摇菌和提质粒，最终用内切酶NcoⅠ和SacⅠ进行单双酶切检测，双酶切产生约11 559 bp和1 378 bp的预期片段，单酶切产生约12 937 bp的预期片段（图1）。研究表明，MvNHX1启动子已成功插入到pCAMBI

A1304上的多克隆位点，已成功构建出新的植物表达载体pMvNHX1：GUS。

2.2 含植物表达载体农杆菌阳性菌株的PCR检测

对转pMvNHX1：GUS的农杆菌质粒用MvNHX1启动子的特异引物扩增出预期大小的条带（图2）。说明植物表达载体pMvNHX1：GUS都已成功地转入到农杆菌EHA105菌株中。

3 结论与讨论

以前期克隆得到的新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子为研究对象，采用分子生物学研究方法，成功构建获得由MvNHX1启动子驱动的植物表达载体pMvNHX1：GUS，为利用农杆菌介导法将MvNHX1启动子驱动GUS基因表达的植物表达载体转入烟草中，通过GUS化学组织染色分析不同胁迫处理下GUS表达活性，进而研究MvNHX1启动子的功能奠定基础。

前期研究结果表明，新牧1号苜蓿受高盐和干旱的诱导产生抗逆相关基因MvNHX1，因此，进一步采用基因工程技术，揭示新牧1号苜蓿MvNHX1诱导表达启动子生物学功能，其结果不仅可为苜蓿转基因工程提供可用的内源启动子，为苜蓿启动子研究奠定基础，而且可丰富和拓宽耐盐基因工程可用基因和启动子资源库，促进我国广大盐渍化地区的开发和利用。

参考文献：

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（责任编辑：卢红玲）

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