对照和空白对照（仪器型号：ABI Step One Plus TM Real-Time PCR Instrument）。CK19正向引物：5’AGGAGATTGCCACCTACCG3’，反向引物：5’CC TTCCC ATCCCT CTACCC 3’；内参基因GAPDH正向引物：5’CTCTC TGCT CCTCCT GTTCGAC 3’，反向引物：5’GCCCAATACGACCAAATCCG 3’。
1.3 统计学方法
采用SPSS 23.0 统计学软件进行统计分析。数据为分类资料，CK19 mRNA拷贝数的比较采用χ2检验。分析甲状腺癌患者 RT-qPCR 法检测CK19的阳性率，对比免疫组化与RT-qPCR法检测方法是否存在差异。多因素分析采用二分类Logistic回归模型分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化结果
48例 cN0 甲状腺癌患者中，术中共取到 212 枚中央区清扫淋巴结标本，平均4.4枚。经病理证实转移 76 枚，病理证实无转移 136 枚。病理证实无转移的136 枚淋巴结行进一步检测。根据上述免疫组化判定结果，CK19阳性的数目分别为 21例，余27例为无转移患者。见封三图1。
2.2 RT-qPCR检测结果
采用Primer 5.0软件设计检测GAPDH、CK19引物，并进行2对引物扩增特异性分析。2对引物具有较好的扩增特异性，能保证样品中目的基因准確检测，见封三图2～3。48例甲状腺癌患者的136枚病理证实无转移淋巴结中，免疫组化CK19阳性数目为21枚。通过RT-qPCR检测CK19，阳性数目为112枚。CK19基因RT-qPCR检测法较免疫组化具有更高的阳性检出率，两种方法比较，差异有统计学意义[15.44（21/136） vs 82.35%（112/136），P<0.05]。见表1。
表1 CK19在免疫组化和 RT-qPCR两种方法中的表达比较
2.3 淋巴结微转移的临床病理特征及影响因素
将患者的各项临床病理相关因素作为自变量，以淋巴结微转移因素作为因变量，筛选淋巴结微转移的危险因素。采用分类变量Logistic回归分析：将性别、年龄、病理T分期、病灶个数、包膜侵犯、单双侧、腺内播散等因素引入分析，结果提示：包膜侵犯是淋巴结微转移的主要危险因素，其余变量比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。Logistic回归分析结果见表3。
3 讨论
甲状腺癌多数属于低度恶性、进展相对缓慢，未发生转移的甲状腺癌患者术后10年生存率超过80%[13]。据统计超过90%的甲状腺乳头状癌可检测到淋巴结微转移。微转移是恶性肿瘤发展过程中播散于淋巴系统、血循环及骨髓等器官中的微小肿瘤细胞灶，是肿瘤局部复发和远处转移的根源，是影响患者预后的因素，鉴别是否发生淋巴结微转移对于临床处理具有较大的指导意义。对于有淋巴结累及的患者应行淋巴结清扫（包括中央区和/或侧颈部），但对于术前超声检测及术中探查未发现明显可疑淋巴结的患者是否应行常规清扫仍有争议。目前为止，还没有非常可靠的技术和检测指标能用于准确评估甲状腺癌的转移。
CK19是一种低分子量角蛋白，主要在上皮细胞中表达，但不会在间质组织中表达，是一个上皮组织来源肿瘤特异的微转移标志物[14]。在甲状腺癌中可以强烈而弥漫的表达，而在正常甲状腺组织、结节性甲状腺肿中不表达或灶状表达，可用于预测甲状腺癌淋巴结微转移。已有不少研究显示：CK19的表达能反映甲状腺乳头状癌淋巴结微转移的状态[15-17]。
运用RT-qPCR技术对比目前普遍采用的HE染色技术对淋巴结微转移的检测分析比较，RT-qPCR 技术是较为灵敏的方法，可以检测淋巴结的微小转移。本研究用免疫组化和RT-qPCR方法对136枚甲状腺癌淋巴结组织的CK19进行检测，其中RT-qPCR法阳性检出率更高，两种检测方法比较差异具有统计学意义（P<0.05）。在本研究中可见RT-qPCR 技术比免疫组化更敏感。因此，在影像学检查及触诊未及颈淋巴结的cN0患者中，可对清扫术后病理阴性淋巴结标本进一步应用RT-qPCR技术检测淋巴结微转移的状况。对于RT-qPCR检测结果阳性的患者可考虑选择较为积极的治疗策略如颈淋巴结清扫术，或严密随访必要时手术。反之则可选择暂不行淋巴结清扫，定期复查。
检测甲状腺乳头状癌淋巴结微转移可作为病理状态的有效补充，但本研究结果显示，cN0甲状腺乳头状癌淋巴结的微转移与甲状腺癌患者大部分的临床病理高危因素无显著统计学差异。张磊等[18]在cN0甲状腺乳头状癌常规病理淋巴结转移的多因素分析中显示非微小癌、男性、年龄<40岁是淋巴结转移的高危因素。一些研究[19-23]也认为男性，年龄<45岁、肿瘤有腺外侵犯、多病灶者，淋巴结转移发生率明显增加。但本研究中在肿瘤的大小、性别、年龄这三个因素中，均未显示是淋巴结微转移的危险因素。一方面与本研究的样本量小有关，另一方面也提示，淋巴结微转移的高危因素的筛选较常规病理的转移更为困难，说明微转移发生在较早的肿瘤进展过程中，预测该相关因素与临床病理特征，需要进一步深入研究。
本研究发现甲状腺包膜侵犯这一因素是淋巴结微转移的独立危险因素。优势比OR=4.000意味着伴有包膜侵犯的患者，发生淋巴结微转移的危险是无包膜侵犯的4倍。因此伴有包膜侵犯的患者需要更多的关注淋巴结的处理方法，包括中央区淋巴结的积极清扫，右侧甲状腺癌的患者，还有必要行右侧喉返神经深面淋巴结的清扫等。
总之，本研究一方面认为RT-qPCR法检测甲状腺癌微转移具有相对优势。另一方面，淋巴结微转移的预测模型的优化建立需要扩大样本量，并关注包膜侵犯这一因素，具有一定的临床指导意义。
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（收稿日期：2016-06-12）