[摘要]为了研究人参皂苷Rh2对人白血病细胞K562的凋亡作用，并从自噬角度来探讨其机制。实验采用CCK8方法检测人参皂苷单体Rh2对人白血病K562细胞增殖抑制作用；流式细胞术检测细胞凋亡；Hoechest染色观察细胞核染色质的形态；吖啶橙和MDC染色观察Rh2对细胞自噬的影响；Western blot和RTPCR检测Rh2对白血病细胞自噬重要基因的表达的影响；运用自噬抑制剂（3MA）研究自噬对细胞增殖和凋亡的影响。CCK8显示人参皂苷Rh2在低浓度时能有效抑制白血病细胞增殖，且其抑制作用具有浓度和时间依赖性；FCM和Hoechest显示Rh2能增加细胞的凋亡和染色质呈凋亡形态改变；吖啶橙和MDC染色发现Rh2组细胞的绿色荧光增强，并出现大量酸性自噬小泡；Western blot和RTPCR结果发现Rh2能上调Beclin1，LC3A，LC3B，激活型Caspase3和pp38的表達；运用细胞自噬剂（3MA）会削弱Rh2对K562的增殖抑制和促凋亡作用。人参皂苷Rh2可能通过激活磷酸化的p38，诱导细胞自噬途径，从而抑制K562细胞增殖和促进凋亡作用。
[关键词]人参皂苷Rh2； 白血病； 自噬； 凋亡
白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，是国内十大高发恶性肿瘤之一。迄今，白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗，但此疗法副作用甚大，复发率很高，尤其对机体免疫与造血系统有极大的损害。因此，可以从传统的中药中寻找天然低毒的药物来治疗白血病。其中人参Panax ginseng CAMeyer是我国传统中草药，在肿瘤的治疗方面具有很高的药用价值[1]。S型人参皂苷单体Rh2[（S）Rh2]是人参中天然活性成分之一，是一种从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物，其毒性低，相对分子质量小，脂溶性好，具有很强的抗肿瘤活性[2]。
目前大家认为，细胞死亡包括3种类型：即坏死、凋亡和自噬性细胞死亡，其中，自噬是属于比较热门的Ⅱ型细胞程序性死亡方式[3]。细胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更为主动和重要的角色。自噬在肿瘤细胞起到双刃剑作用，可以保护肿瘤细胞，也可以杀伤肿瘤细胞[4]。作者选取人红白血病K562细胞株作为研究对象，为了进一步弄清楚人参皂苷Rh2对白血病的药理作用，并从自噬途径研究人参皂苷Rh2促进人白血病细胞自噬凋亡机制，为Rh2应用于临床治疗白血病奠定实验和理论基础。
1材料
11K562细胞株人红白血病K562细胞株购自上海ATCC细胞库。每次取对数生长期的K562细胞以5×108个/L接种于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养，每2～3 d传代或换液。
12药品Rh2购自成都曼斯特科技有限公司（纯度98%），取200 μL DMSO加入20 mg Rh2使之充分溶解，配制成100 mg·L-1原液，-20 ℃冷冻保存。实验前用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释成所需浓度。
13试剂胎牛血清，RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司）；CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所）；Annexin VPI双标凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制剂（美国Sigma公司）；MAPK通路抗体试剂盒，Beclin1，LC3A/B多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology）；Bcl2，Bax多克隆抗体（美国Epitomics公司）。
14仪器超净工作台（Sanyo）；倒置显微镜、倒置荧光显微镜（Olympus）；低温离心机（Sigma）；酶标仪，垂直电泳仪，电转仪，ChemiDocXRS化学发光成像系统，PCR仪（BioRad）；二氧化碳培养箱（Thermo）。
2方法
21CCK8 法培养对数生长期的K562细胞，以1×104 个/孔接种于96孔板中。分为空白对照组、药物组和本底对照组，每组设6个复孔，每孔200 μL，（S）Rh2 20～100 μmol·L-1；本底对照组：只加RPMI 1640培养液。培养24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8检测液，轻轻摇匀，孵育25 h 后，用酶标仪（波长450 nm）检测每孔吸光度（A），并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50）。
22FCM检测早期凋亡培养对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度分别至5×108 个/L，接种于6孔细胞培养板中。实验分为4组：Ⅰ组为空白对照组，正常培养；Ⅱ组加入（S）Rh2 60 μmol·L-1；Ⅲ组加入5 mmol·L-1的自噬抑制剂3MA；Ⅳ组同时加入（S）Rh2 60 μmol·L-1和3MA 5 mmol·L-1。每孔3 mL培养液，在37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养24，48 h后，分别收集各组细胞，用预冷001 mol·L-1PBS（pH 72）洗涤2次，4 ℃ 1 200 ×g离心5 min。加入RNA酶和碘化丙啶（PI） 和Annexin V，置于冰上染色处理30 min，每组细胞2×104个，上流式细胞仪检测，重复实验3次。
23Hoechst染色取对数生长期的K562细胞调整细胞密度为5×108 个/L，接种于6孔培养板。实验分组：空白对照组含01% DMSO的RPMI 1640完全培养液；药物组60 μmol ·L-1的Rh2培养48 h后，收集空白对照组和药物组细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，加甲醇乙醇（3∶1）固定液室温固定15 min；离心去除固定液加Hoechst染色液避光、室温染色30 min，PBS洗涤1次，调整细胞浓度，滴片，荧光显微镜下观察。
24吖啶橙染色K562细胞用人参皂苷（S）Rh2 60 μmol·L-1处理24 h后，收集细胞，新选配制的吖啶橙（2 μ·mL-1），37 ℃避光孵育15 min，在EP管中，用PBS漂洗3次后，调整细胞浓度，取一滴细胞悬液滴到玻片上，待细胞沉积到玻片上时，吸去上层液体，封片置于荧光显微镜下观察酸性的自噬小泡。50%甘油封片，置于倒置荧光显微镜下观察、采图，实验重复3次。
25Western blot取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度到5×108 个/L，接种到细胞培养瓶中。实验分组为对照组和药物组（S）Rh2（20，40，60 μmol·L-1），置培养箱中常规培养。提取蛋白并将各组蛋白浓度调成4 g·L-1，沸水中煮沸5 min，蛋白完全变性后，冷却，每个样品取10 μL加入泳道中，保证每孔中有40 μg待测蛋白样品，行SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，分别加入抗体MAPK信号通路抗体按1∶500稀释；Bcl2，Bax，Caspase3（激活型），LC3A和LC3B按1∶1 000稀释抗体，及Beclin1和βactin按1∶2 000稀释抗体，4 ℃孵育过夜；用TBST漂洗3次，每次10 min置于脱色摇床上；分别加入以1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，再用TBST漂洗3次，每次10 min置于脱色摇床上；最后在保鲜膜上滴入ECL化学发光液，在暗室进行X胶片曝光，洗片，胶片晾干后。扫描胶片，Quantity One软件定量分析，此实验重复3次。
26RTPCR参照试剂盒说明书进行，Trizol提取细胞总RNA。采用TAKARA反转录酶试剂盒逆转录cDNA。应用TAKARA的SYBRⅡ试剂，PCR反应体系为10 μL。检测自噬重要基因的mRNA 水平。引物由上海生工生物公司提供，引物序列见表1。以GAPDH为内参基因，用目的基因与GAPDH 的起始拷贝数比值表示目的基因的相对表达量，实验重复3次。
3结果
31CCK8检测细胞增殖抑制能力药物组与对照组比较，人参皂苷（S）Rh2能有效抑制白血病K562细胞增殖，并呈浓度和时间依耐性且K562细胞48 h的IC50为60 μmol·L-1。因此，选择Rh2（60 μmol·L-1）作为实验研究最大浓度，见图1。
32流式细胞术测细胞凋亡Rh2 （60 μmol·L-1） 处理K562细胞24 h 后，FCM检测结果显示加药与对照组比较1）P<005（图5，6，8同）。
组细胞早期和晚期凋亡数量明显增多，其早期凋亡率分别为（1200±260）%，且随着浓度的增高，早期凋亡率增高，分别与对照组（318±052）%相比，差异有统计学意义（P<005）；晚期凋亡率分别为（1632±345）%，且随着浓度的增高，晚期凋亡率增高，分别与空白对照组（319±073）%相比，差异均有统计学意义（P<005）。
33Hoechst染色检测细胞凋亡Rh2（60 μmol·L-1）诱导K562细胞48 h后，用Hoechst染色显示，细胞核出现染色质浓缩、核碎裂、核边集的细胞凋亡现象，并且细胞发出蓝色荧光较对照组细胞强，见图2，说明Rh2能诱导K562细胞凋亡。
34MDC染色观察细胞自噬人参皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）处理K562细胞24 h后，用MDC染色后，观察细胞内绿色荧光强度，见图3，经人参皂苷（S）Rh2诱导后，K562细胞中的酸性自噬小泡均明显增加，对照组绿色的自噬小泡基本看不见，说明人参皂苷（S）Rh2能够增强细胞自噬。
35吖啶橙染色观察细胞自噬人参皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）处理K562细胞24 h后，用吖啶橙染色后，观察细胞内的自噬体，见图4，细胞内绿色代表酸性自噬小体，红色代表核仁，经人参皂苷（S）Rh2诱导后，K562细胞中的酸性自噬小泡均明显增加，对照组绿色的自噬小泡基本看不见。
36RTPCR检测自噬重要调控基因的表达与对照组比较，K562细胞经60 μmol·L-1的（S）Rh2作用24 h后，自噬相关基因（Atg3，Atg5，Atg7，Atg12）在2种细胞中变化不明显，而自噬重要调控基因Beclin1，LC3A，LC3B的表达却明显上调，差异有统计学意义（P<005），见图5。
37Western blot检测自噬重要蛋白的表达与对照组比较，K562细胞经不同浓度的（S）Rh2作用后，Beclin1，LC3A，LC3B蛋白的表达水平明显增高，见图6。人参皂苷（S）Rh2能在分子水平上增加自噬重要的蛋白和基因的表达，进一步确定了（S）Rh2能诱导白血病K562细胞发生自噬。
38（S）Rh2通过自噬抑制细胞增殖作用CCK8检测细胞的增殖能力，发现单独用自噬抑制剂3MA能轻微降低细胞活力，但是无统计学意义；单独使用（S）Rh2能明显降低细胞活力，差异有统计学意义（P<005）；然而在联合加入自噬抑制剂3MA和（S）Rh2后，与单独加入（S）Rh2組比较，细胞活力有明显的回升，差异有统计学意义（P<005），说明
39（S）Rh2通过自噬诱导细胞凋亡用流式细胞术检测细胞凋亡发现，细胞加入自噬抑制剂时，与对照组比较无明显改变；单独使用（S）Rh2时，细胞凋亡明显增加，差异有统计学意（P<005）；然而在联合加入自噬抑制剂3MA和（S）Rh2后，与单独加入（S）Rh2组比较，细胞凋亡有明显下降，差异有统计学意义（P<005），说明细胞自噬能增强人参皂苷（S）Rh2对白血病K562细胞的促凋亡作用，见表2。
310Western blot检测自噬对（S）Rh2诱导细胞凋亡作用的影响单独运用自噬抑制剂3MA后，细胞自噬关键蛋白LC3A/B有下降的趋势，单独运用（S）Rh2后，细胞自噬关键蛋白LC3A/B和激活型的Caspase3表达明显上升，当同时加入自噬抑制剂3MA和（S）Rh2后，细胞的自噬关键蛋白LC3A/B和激活型Caspase3的表达比单独运用（S）Rh2时明显下降，说明抑制自噬后细胞凋亡现象减少，自噬可促进人参皂苷（S）Rh2诱导K562的凋亡作用，见图7。
与对照组比较1）P<005，与Rh2组比较2）P<005。
311Rh2通过激活磷酸化p38调控K562细胞自噬凋亡10，20，40，60 μmol·L-1Rh2 作用于K562细胞24 h后，Western blot结果显示，p38蛋白的表达几乎没变化，pp38的表达增加，提示Rh2可能通过激活磷酸化p38调控K562细胞自噬凋亡，见图8。
4讨论
目前，许多研究者认为自然界中有丰富抗肿瘤的天然药物，本课题组前期实验表明人参提取物人参总皂苷和单体能在体外抑制白血病和肝癌细胞增殖，阻滞周期，促进凋亡。其他国内外研究人员也研究证实，人参皂苷单体能抑制各种肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞发生凋亡[56]。因此采用CCK8法研究人参皂苷单体Rh2对白血病细胞K562增殖抑制作用，发现人参皂苷单体Rh2能有效抑制白血病细胞的增长。通过流式细胞术发现人参皂苷单体Rh2能促进细胞发生凋亡，Hoechst染色同样证明了Rh2能诱导细胞凋亡。Western blot检测发现Rh2能够
增加Bax/Bcl2的比例，同时激活Caspase3，说明了Rh2能通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。
细胞自噬和凋亡密切相关，凋亡的早期，细胞出现应激反应，会出现自噬。为了探讨人参皂苷（S）Rh2对白血病细胞自噬的关系，运用了吖啶橙和MDC染色。发现加药组早期细胞出现酸性的自噬泡，PCR和Western blot结果显示自噬相关基因和蛋白分子（Beclin1，LC3A和LC3B）的表达均升高，证明了人参皂苷（S）Rh2能诱导白血病细胞发生自噬。 自噬异常与肿瘤的发生发展关系密切，可以从不同生物学行为影响肿瘤的进程，其中有细胞周期、增殖、凋亡、耐药、血管生成及肿瘤的治疗等方面的调控[7]。文献研究报道，自噬和细胞凋亡的关系存在两面性，维持细胞生存和促进细胞死亡[8]。前面的实验证明了人参皂苷Rh2既能诱导白血病K562细胞凋亡又能诱导其发生自噬，那么细胞自噬和凋亡关系是怎样的呢？实验表明，当同时加入自噬抑制剂3MA和Rh2时，与单独加入Rh2相比，K562的细胞凋亡减少和细胞活力增强。说明抑制细胞自噬，可削弱人参皂苷Rh2对白血病细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用，提示人参皂苷Rh2可以通过诱导白血病细胞发生自噬，促进细胞凋亡。
目前，MAPK信号通路能调控自噬和细胞凋亡[9]。作者前期的研究已经证实人参皂苷Rh2诱导细胞自噬，3甲基腺嘌呤（3MA）通过抑制ClassⅢ PI3K 的活性抑制自噬，抑制细胞自噬可以削弱人参皂苷Rh2对K562的抑制增殖和促凋亡作用[10]。为了研究人参皂苷Rh2诱导细胞自噬凋亡的可能机制，作者运用了Western blot检测MAPK信号通路的关键的蛋白p38，发现人参皂苷Rh2分别能够激活p38，发生磷酸化激活。证明了参皂苷Rh2可能能通过激活磷酸化p38调控K562细胞自噬凋亡。
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[責任编辑张宁宁]