IFN—γ和IL—1在鼻咽血管纤维瘤中的表达及其意义

对照组10例下鼻甲组织术后诊断为下鼻甲慢性炎症，患者年龄18～40岁，平均25岁，其中男5例，女5例。标本来自2015年3～6月温州医科大学附属第一医院耳鼻喉-头颈外科，在内窥镜下取鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者的下鼻甲组织。标本均是24 h内取材，应用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 试剂

兔抗人IFN-γ单克隆抗体购自SANTA CRUZ公司和兔抗人IL-1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

操作严格按照说明书进行，步骤如下：①烤片，68℃，20 min；②常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-100%酒精Ⅰ10 min-100%酒精Ⅱ10 min-95%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min；③阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10 min，PBS冲洗3×5 min；④抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸（95℃，15～20 min），自然冷却20 min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3×5 min；⑤正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗；⑥滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5 min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；⑦滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min；⑧DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。用PBS代替第一抗体作为阴性对照，用已知阳性片做阳性对照。

1.4 免疫组化结果判断[6]

IFN-γ和IL-1的阳性染色者细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着，阳性细胞数：0分为无阳性细胞，1分为阳性细胞数<25%，2分为阳性细胞数占25%～50%，3分为阳性细胞数占51%～75%，4分为阳性细胞数占>75%。染色强度：0分为无染色，1分为弱染色，2分为中等强度染色，3分为强染色。计算各抗体的阳性细胞数和染色强度得分，以3～7分为阳性。

1.5 统计学分析

应用SPSS13.0 统计学软件进行分析，IFN-γ和IL-1阳性表达率采用χ2 检验或者精确概率法进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-γ和IL-1的阳性表达

主要位于JNA血管壁内皮细胞和基质成纤维细胞的胞浆中，呈棕黄色。IFN-γ和IL-1在下鼻甲组织中弱表达或无表达，弱表达颗粒主要位于成纤维细胞胞浆、血管内皮细胞的胞浆和浆液性腺体中，着色强度不一，见封三图1。分别对JNA组和下鼻甲组的IFN-γ和IL-1阳性表达率分别进行比较，见表1～2。JNA组中的IFN-γ的阳性表达率为100%（20/20），下鼻甲组中的IFN-γ阳性表达率为20%（2/10）， JNA组中的IFN-γ表达水平明显高于下鼻甲组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。 JNA组中的IL-1的阳性表达率为100%（20/20），下鼻甲组中IL-1的阳性表达率为20%（2/10），JNA组中的IL-1表达水平明显高于下鼻甲组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。

2.2 IFN-γ和IL-1蛋白在鼻咽血管纤维瘤的不同临床分期中的阳性表达率

本研究表明IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤的不同临床分期中的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3、4。

3 讨论

IFN-γ对于破骨细胞的调控有不同的观点，有研究显示[7]IFN-γ通过快速降解RANK的衔接蛋白-TRAF6 来干扰细胞内RANKL信号的传导，抑制破骨细胞的形成。然而Gao 等[8]报道 IFN-γ 会刺激破骨细胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表达上调，进一步刺激T 细胞的活化，活化的T细胞可以产生大量的TNF-α和RANKL，这两项研究认为IFN-γ 这种间接作用已经超过其对破骨细胞前体的抑制作用，进一步导致破骨细胞的形成，造成骨质破坏。Kohara H等[9]研究发现IFN-γ直接抑制破骨细胞生成和诱导细胞凋亡Fas/FasL信号提供，导致骨吸收的间接调控，这是在炎症部位对骨破坏的保护作用。金玲爽等[10]报道在胆脂瘤中耳炎患者外周血中检测IFN-γ，显示 IFN-γ促进慢性中耳炎骨质破坏，其结果与马志超等[11]研究结果相似。IL-1（interleukin-1，IL-1）是一种单核因子，最主要由活化的单核-巨噬细胞产生，成纤维细胞和朗罕氏细胞也可合成和分泌IL-1。IL-1的生物学活性比较广泛，可作用于机体的各个系统。IL-1可刺激骨细胞产生前列腺素E2（PGE2），然后PGE2再刺激破骨细胞，促进骨质的破坏吸收[12]。Zhang H等[13]研究发现IL-1受体拮抗剂阻断肌源性干细胞分化为破骨细胞和骨吸收，而且IL-1α可进一步增强破骨细胞分化和骨吸收。Hienz SA等[14]研究发现肿瘤坏死因子-α、IL-1β、PGE2促进破骨细胞的活性，特别是在出现炎症时如发现牙周炎状态。有研究显示白细胞介素-1β是重要的促炎性细胞因子，其参与了RA的发病机制，主要引起关节炎症和关节软骨破坏[15-18]。Ruscitti P等[19]研究证明白细胞介素（IL）1β是最强大的促炎细胞因子之一，是一种强刺激因素，在体外和体内通过刺激破骨细胞RANKL上调，促进骨吸收。已有研究报道，IL-1存在于胆脂瘤上皮、基质，明显表达于邻近胆脂瘤的单核细胞、骨细胞、角化的上皮细胞，于正常的外耳道皮肤也有表达，但在正常皮肤的表达明显低于胆脂瘤上皮[20]。虽然有研究证明无论有无胆脂瘤，IL-1均可导致慢性中耳炎骨质吸收。但也有研究显示，当胆脂瘤存在时，骨破坏的范围更大，程度更严重[3]。本研究结果显示，IFN-γ和IL-1蛋白在JNA中的阳性表达率均为100%，明显高于IFN-γ和IL-1蛋白在下鼻甲组织中的阳性表达率20%，两者间有明显的统计学差异。但是本研究中IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纤维瘤的不同临床分期中的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05），表明IFN-γ和IL-1蛋白与鼻咽血管纤维瘤的扩张性生长无显著相关。我们推测IL-1刺激成骨细胞产生前列腺素 E2、IL-6可刺激破骨细胞前体细胞的分化，而前列腺素E2和 IL-6又可刺激骨吸收，导致骨质破坏。IFN-γ可能刺激破骨细胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表达上调，进一步刺激T 细胞的活化，活化的T细胞可以产生大量的TNF-α和RANKL，IFN-γ 这种促进作用形成破骨细胞，导致骨质破坏。本研究认为IL-1和TNF-γ在JNA骨质破坏中可能参与两种主要病理过程：①刺激成骨细胞产生前列腺素等炎症介质；②通过刺激破骨细胞，减少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并产生胶原酶和其他中性蛋白酶，释放骨钙等，从而导致骨质的破坏。IFN-γ和IL-1虽然与鼻咽血管纤维瘤的扩张性生长无显著相关，但IFN-γ和IL-1蛋白在JNA组织中有较高的阳性表达率，我们推测其可能是参与JNA骨质破坏的影响因素，其具体机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2016-03-10）

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