摘要 阐述了PCR和ELISA这两种技术在食源性致病菌检测中的研究，并对这两种方法特点与应用进行了探讨。
关键词 PCR；ELISA；致病菌检测
中图分类号 TS207.4文献标识码A文章编号1007-5739（2008）09-0182-03
近几年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况进行了连续的动态监测，结果表明，微生物源性食物中毒占居首位，高达39．62％[1]。随着食品工业的发展以及对食品安全的重视，传统分析方法已经远不能满足食品检测的需要，迫切需要灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法。因此，近年来世界各国的许多机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究，改进和开发了一些快速的检测技术和方法。其中聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）以其简便、快速、灵敏、成本低、检测谱广等特点在食源性致病菌检测方面的应用也越来越受到人们的青睐。
1PCR技术
PCR技术即聚合酶链式反应，也称无细胞克隆系统，是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术，该技术自问世以来，就以惊人的速度广泛地应用于生命科学的众多领域。目前在食品工程领域中致病微生物、转基因食品的检测等方面的应用也越来越受关注。
1.1PCR技术原理
PCR是在体外合适条件下，以单链DNA为模板，以1对人工合成的寡核苷酸为引物，在热稳定DNA聚合酶作用下特异性扩增DNA片段的技术。整个反应过程通常由20~40个PCR循环组成，每个PCR循环包括高温变性—低温复性—适温延伸3个步骤。方法是：首先将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入2段人工合成的与靶DNA 两端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物；该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后，在有DNA聚合酶和4种dNTPs底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5′末端向3′末端方向延伸，自动合成新的DNA双链，新合成的DNA双链又可作为扩增的模板，继续重复以上的DNA聚合酶反应。经过20～40次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。
1.2PCR技术在食品致病菌检测中的应用
利用PCR检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的DNA释放，纯化后经PCR扩增细胞靶DNA的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。
1.2.1单核细胞增生李斯特氏菌的检测。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是食品卫生中的重要病原菌，多通过食品经口感染，被列为20世纪90年代食品中的四大病原菌之一。过去对食品中LM进行检测时，克隆培养的标准方法需要3～4周的时间才能得出结果。国外已广泛将PCR技术用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌，国内的报道也不少。杨百亮等（1994）通过条件优化，建立了快速检测牛奶中单核细胞增生李斯特菌的试剂盒[2]，并在同年报道了以l对位于该菌β-溶血素基因内的26bp寡核苷酸为引物，用PCR对市售猪肉和牛奶中的单核细胞增生李斯特菌的检测[3]。金大智等运用实时荧光PCR（Real-time PCR）技术建立对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性。对26种病原菌进行的检测结果表明，用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感，特异性更高。
1.2.2金黄色葡萄球菌的检测。金黄色葡萄球菌肠毒素（SE）可引起人类中毒，其内毒素——中毒休克综合症毒素（TssT1）可引起中毒休克综合症，产生的脱皮毒素（ETA、ETB）与一系列脓疱性葡萄球菌感染有关。金黄色葡萄球菌肠毒素是一种可溶性耐高热蛋白，根据血清型别不同，分为A、B、C、D和E等5个型。所有的金黄色葡萄球菌肠毒素都有一个相同的基本结构即含有二硫键和单一多肽链。其中肠毒素D（SED）的基因位于质粒上，由256个氨基酸残基组成，基因长为774个碱基对，已全部定位。目前金黄色葡萄球菌肠毒素D的鉴定主要是依赖于免疫学技术，该技术需要细菌纯培养和制备肠毒素，试验周期长、步骤繁多，使其在食品卫生学鉴定时受到限制，近年来PCR技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径。云泓若等（1999）选择SED基因的第360～381对碱基为上游引物，第654～675对碱基为下游引物，应用PCR技术扩增出SED基因的316bp长的DNA片段，并建立了直接利用细菌裂解液作为模板的PCR方法[4]。
1.2.3沙门氏菌的检测。Nguyen等根据肠炎沙门氏菌c7克隆株具有的属特异性序列（2.1kb HindIII片段）设计出1对引物，能快速地检测出肉食品标本中的沙门氏菌，检测的敏感性和特异性均为100％，这保证了检测的准确性。沈孝民用PCR技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物进行了检测，结果显示该方法特异性高，且灵敏、快速，并可在1d之内完成[5]。
1.2.4致病性大肠杆菌的检测。肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病因之一。该菌可产生2种肠毒素：热敏性肠毒素LT和耐热性肠毒素ST，它们均能引起肠黏膜细胞水与电解质的代谢紊乱并导致腹泻。ETEC引起的腹泻主要是食入了被该菌污染的食品所致。PCR技术为临床和实验室提供了一个更为快速灵敏的检测手段。王嘉福等（1997）根据LT和ST基因序列，合成了引物，并对128份食品样品中ETEC肠毒素基因（LT和ST"）片段进行扩增，结果共有15个样品被检出污染了ETEC，并且证实用于扩增的引物具有高度特异性[6]。卢林耿等（1999）用PCR法检测大肠杆菌0157的志贺样毒素基因，试验表明引物具有高特异性[7]。
1.3PCR技术存在的主要问题及展望
1.3.1污染问题。PCR是一种极为灵敏的反应，一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果，所以在操作时必须加以注意。
1.3.2假阴性问题。食品是复杂的反应基质，影响PCR反应的因素很多，如果不能有效排除各影响因素的干扰，很可能出现假阴性结果。此外，如果在PCR操作过程中各种试验条件控制不当，很容易导致产物突变，也会导致假阴性结果。对于这些问题必须有充分的考虑和排除措施。
1.3.3引物设计及靶序列选择。引物的设计及靶序列的选择是决定PCR结果的关键因素，引物不同则扩增物不同，如果引物的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低PCR检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因而，必须对扩增序列有充分的了解，并规范PCR实验室操作技术。
1.3.4PCR技术应用展望。尽管还存在着一定的问题，但由于PCR技术可以快速特异地扩增任何期望的DNA片断和目的基因，因而在食品检验领域有重要的实际应用价值。相信随着该技术的进一步普及、发展和完善，PCR技术将会得到更加普遍地应用和发挥更大的作用。
2ELISA技术
ELISA是一种非放射性标记免疫分析技术。20世纪70年代初，由Engvall及Van Weemen等在放射免疫分析的基础上建立起来的一种非均相的酶免疫检测技术。
2.1ELISA原理
ELISA的基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应，免疫复合物所携带的酶分子可将特定的底物分子转化为具有特定颜色的化合物，并由颜色的深浅反映样品中抗原或抗体分子的量。该方法具有灵敏、特异、快速、稳定以及易于自动化操作等特点。
2.2ELISA技术在食品致病菌检测中的应用
2.2.1沙门氏菌的检测。田银芳等[8]应用直接ELISA方法对350份奶样进行沙门菌的检测。与常规方法相比，该方法的敏感性和特异性分别为100％和99.7％。张艳红等[9]则利用单克隆抗体建立了一种竞争ELISA方法，与国标法相比灵敏性、特异性分别为94.4％和97.7％。杨静等[10]利用2株单抗建立的直接ELISA方法对沙门菌属有高度的特异性，且对A-F群代表菌株的最小检出量为10cfu/L。这充分展示ELISA的特点，而且显示出与国标法相比的优势。另外，还有研究者将其他分离技术与ELISA结合起来以缩短检测周期和降低检测限。Mansfield LP等[11]将免疫磁珠分离技术与ELISA联合起来建立一个检测系统。该系统对生鸡肉和饲料的检测限为2×103cfu/25g，整个检测过程耗时不足27h，其中包括18h传统的前增菌和6h葡萄糖营养肉汤培养的样品预处理过程；而传统方法需要72～96h。这对于快速检验是一个很好的尝试。
2.2.2大肠杆菌0157的检测。大肠杆菌0157也是严重危害人类身体健康的食源性致病菌，可导致人畜死亡。赵志晶等研究获得了抗肠出血性大肠杆菌0157：H7的多克隆抗体，建立了用于食品样品检测的双抗ELISA检测方法。该方法对纯培养菌液检测限为103~104cfu/mL；只对0157菌株有特异性反应，对非0157菌株无交叉反应；经过增菌，鸡肉与牛奶染菌样品中的大肠杆菌0157的检出下限均为0.1cfu/g（mL）。Norval JC等 建立一种磁性微球结合酶联免疫吸附试验，可以在3h内检测到103cfu/mL的大肠杆菌0157：H7。这极大地缩短了检测周期并降低了检测限。SongJM等建立一种ELISA为辅助的高通量生物芯片系统，该方法大肠杆菌细胞检测限可达3cfu/mL，很大程度上提高了检测速率，降低了检测劳动强度。近些年，随着对检测灵敏度和检测时间要求的不断提高，人们又将PCR和ELISA方法结合到一起，从而创造了PCR-ELISA技术。该技术是以ELISA特异性捕获的微生物为模板进行PCR扩增，从而提高检测灵敏度。例如，2002年Ge BL等建立一种检测食品中的大肠杆菌0157：H7和产志贺毒素大肠杆菌的 PCR-ELISA方法。该方法可以检测到0．1～10.0cfu的产志贺毒素大肠杆菌和志贺毒素基因；还可以无需任何增菌即可在牛肉中检测到105cfu/g的菌体。整个检测过程仅需要6h，而且该方法适合于大规模监测和未来的自动化检测。
2.2.3单核细胞增生李斯特菌的检测。L monocytogenes是食源性致病菌中较为特殊的一种菌，该菌可以在食品低温储藏过程中增长而且还可以导致死亡，所以各国对其的检测显得更为关注。1999年，Enne de Boer等[7]利用所建立的ELISA方法经过前增菌后进行L．monocytogemes检测，其检测限达到103~105cfu/mL，而且整个检测过程仅需要16～24h。但是，Sewelld AM等建立一种检测食品中L．monocytogenes的高效快速的酶联荧光检测法，该方法的菌体最佳检测水平为104～105cfu/mL，包括孵育在内整个检测过程仅需要52h。与传统培养鉴定方法相比就大大缩短了检测时间，加快了检测步伐。
2.3ELISA技术存在的主要问题及展望
2.3.1ELISA技术存在的主要问题。首先该方法需要较多的仪器设备，如酶标仪、恒温箱及微量移液器等，不适宜基层现场检测；其次，该技术的操作技巧性较强而且对关键点的控制对结果影响很大。在ELISA方法中重要的是第一步加样，样品加入及混匀过程的误差会在以下的诸多操作中被逐级放大，造成检测结果偏差较大甚至出现假阳性和假阴性。而且，操作过程中易出现孔间交叉污染，出现假阳性；最后，该方法检测限较高，达到106cfu/L[9]。因此，解决以上问题将成为该技术的发展方向和推动力。
2.3.2ELISA技术展望。单一的免疫学检测技术检测限较高是困扰该方法推广应用的关键因素。为了解决这个矛盾，许多学者把其他方法与免疫学方法结合起来以提高检测灵敏性，且大大缩短了样品检测周期。发明更灵敏的检测方法或者发现新的检测靶位点也显得非常重要。同时，如何完全地释放或暴露样品中食源性致病菌的靶位点成为降低检测限的一个突破口。研究开发高效的样品前处理方法便成为充分发挥免疫学检测技术优势的前提，也是免疫学方法在食源性致病菌检测中推广应用的重点。
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