gk] n}ۙ_tϰdڨ3@ME] OO1`a @ M4B ! 羛_`v T]yL L `L p`Qא0La0 mF T] $d dL$miGnF ` 0 07ߝiZўp3@+C4^O 3@<$v佄j̓jE+z]/KghSj%Kgij%K6/;)},M4nsG^i^ /] n}2 ~ے̀)vۙ_ے53ۙ_ذ`E]&_`Q]&_Խwڨ3@Ob4 xK9ߎlmf}mt) G] n}2 ~ے̀)vۙ_ے53ۙ_ذ`E]&_`Q]&_Խyڨ3@Ob 6/7)},9)ӽh<$ui4 HOiGiSTM &1P "https://www.dg9.com.cn/k/duizhao/" target="_blank" class="keylink">对照,以无菌水为模板设空白对照,反应体系及扩增条件同1.6。
1.9 巢式PCR的灵敏度测定
将CaYMV的DNA原液进行10倍梯度稀释,分别以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9不同稀释度的DNA为模板,利用建立的巢式PCR方法进行扩增,同时设阴性对照,测定其灵敏度。
1.10 样品检测
利用建立的巢式PCR方法对口岸送检的一批美人蕉样品(共50份)进行检测。检测方法同1.4~1.7。
2 结果与分析
2.1 PCR鉴定
以提取的DNA为模板,以引物BadnaFP/BadnaRP进行扩增,结果从美人蕉病株中扩增出与预期大小一致的条带,约576 bp,而空白对照和阴性对照均未扩增出相应的特异性条带(图1)。将所得的目的片段进行克隆和测序,测得的序列进行BLAST比对,与已报道的CaYMV序列一致性达97%以上,证实样品携带有CaYMV。
2.2 巢式PCR检测
以第一轮PCR产物为模板,利用设计的内侧引物进行第二轮PCR,结果从带毒样品中扩增出与预期大小一致的条带,约352 bp,而空白对照和阴性对照均未扩增出相应的特异性条带(图2)。将所得的目的片段进行克隆和测序,测得的序列进行BLAST比对,与已报道的CaYMV序列(GenBank登录号:KT447042)一致性达99%。
2.3 巢式PCR的特异性验证
分别以BYMV、CMV、TAV的cDNA以及携带CaYMV的样品DNA为模板,在相同条件下进行巢式PCR,同时设阴性对照,结果从图3可见,仅携带CaYMV的样品在352 bp处出现明亮的DNA条带,其他病毒样品和健康样品均无条带,表明建立的巢式PCR方法具有较强的特异性。
2.4 巢式PCR的灵敏度测定结果
将携带CaYMV样品的DNA按10倍梯度稀释后,分别作为模板,单独使用CaYMVF1/CaYMVR1进行扩增,在1~3泳道均能扩增出540 bp的单一条带(图4a),而使用CaYMVF2/R2进行第二轮PCR扩增,在泳道1~6均能扩增出352 bp的条带(图4b)。第二轮PCR的检测灵敏度比第一轮PCR高103倍,即巢式PCR使检测灵敏度提高了103倍,由此表明,该病毒的巢式PCR的灵敏度明显高于常规PCR,前者的灵敏度是后者的103倍。
2.5 样品检测
检测结果表明,采用巢式PCR法能够从50份美人蕉样品中检测出CaYMV 9份(检出率为18%),比常规PCR检出率(8%)高10个百分点,表明本文建立的巢式PCR方法具有更高的灵敏度。
3 讨论
美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV)是美人蕉上发生率较高的病毒之一,在美國、日本等美人蕉大面积种植的地区发生较为普遍,导致美人蕉的观赏价值和经济价值下降。目前尚未有针对CaYMV有效的防治方法,在美国曾被迫采取销毁病株的方式来防止其进一步扩散,给当地带来较大的经济损失[10]。因此,加强病毒检测,建立针对CaYMV快速、准确的检测方法,对有效防止该病毒随带病植株的远距离运输而扩散,保护我国观赏作物的生产安全意义重大。本文根据已报道的CaYMV序列设计了内、外侧2对特异性引物,在常规PCR的基础上,建立了可用于CaYMV快速检测的巢式PCR方法。
本文建立的巢式PCR方法仅能够从感染CaYMV的样品中扩增到特异性目的片段,而从其他病毒样品及健康样品中均未扩增到相应的目的片段,提高了PCR扩增的特异性,有效避免了非目的片段的扩增。与常规PCR相比,本文建立的巢式PCR方法经过2轮PCR反应,检测灵敏度得到显著提高,使整个PCR检测灵敏度提高了1 000倍(第一轮、第二轮的检测下限分别为10-2和10-5倍稀释的DNA)。应用本文建立的巢式PCR方法对进境的美人蕉样品进行CaYMV检测,检出率为18%,明显高于常规PCR的检出率,因此当CaYMV含量较低时,该方法能弥补常规PCR方法可能存在的漏检问题,使检测结果更为准确可靠。本文建立的巢式PCR检测CaYMV的方法具有快速、简便、特异和灵敏的优点,能够有效应用于CaYMV检测。
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(责任编辑:田 喆)