文章编号：1004-9231(2008)08-0369-03
摘要：[目的] 制备抗麻疹病毒(MV)的单克隆抗体(单抗，McAb)，并用该单抗研制捕获法ELISA检测MV-IgM的诊断试剂盒。 [方法] 以MV减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠，其脾细胞与SP2/0细胞融合，筛选分泌抗MV的杂交瘤细胞株，以获得该单抗，并对用其研制的检测抗MV-IgM试剂盒进行考核。 [结果] 获得的杂交瘤细胞株中，B2能稳定分泌高滴度抗MV单抗。经考核，用该单抗酶结合物研制的检测抗麻疹-IgM试剂盒特异性和稳定性良好，与同类商品试剂盒比较，其检出麻疹病例血清抗MV-IgM的时间较早。 [结论] 应用麻疹减毒活疫苗成功地制备了小鼠杂交瘤细胞，其中B2株能稳定分泌高效的抗MV 单抗，用于研制检测抗MV-IgM捕获法ELISA试剂盒，其敏感性、特异性和稳定性令人满意。
关键词：麻疹病毒；单克隆抗体；抗麻疹病毒-IgM；酶联免疫吸附试验
中图分类号：R 511.1 文献标识码：A
Preparation and usage of the monoclonal antibody from living attenuated measles virus vaccine ZHU Li-hua，CHEN Juan-juan，ZHOU Zhi-tong，et al (Shanghai Public Health Centre Affiliated to Fudan University，Shanghai 201508，China)
Abstract：[Objective] To develop the monoclonal antibody (McAb) against measles virus(MV) and use it to prepare capture ELISA anti–MV specific IgM kit. [Methods] Balb/c mice were immunized with MV attenuated vaccines and their spleen cells were fused with SP2/0 cells. From these mice，the McAb against MV was obtained and used to prepare capture ELISA anti MV specific IgM kit. [Results] B2 strain hybridoma cells could secret McAb against MV in high titer specifically. McAb was used to preparate capture ELISA anti MV specific IgM kit. The specificity and stability of this kit were good. Anti MV-IgM in sera in cases with measles could be detected by this kit earlier than that by a same type commercial kit. [Conclusion] The sensitivity，specificity and stability of the capture ELISA anti–MV specific IgM kit prepared using the McAb are satisfactory。
Key words：Measles virus；Monoclonal antibody；Anti MV specific IgM；ELISA
麻疹是一种高度传染的呼吸道病毒感染，具有典型的临床症状，包括斑丘疹、发热、咳嗽、鼻炎和结膜炎。最近数十年来，全球普遍使用了麻疹疫苗，麻疹的患病数和死亡数大幅度下降，但此病的流行仍有发生。世界卫生组织 (WHO) 估计，2000年麻疹病例≥ 3000万，造成77.7万例死亡[1]。虽然1999—2003年间麻疹相关的死亡数从87.3万例降至53万例，但麻疹病毒仍是发展中国家儿童的发病和死亡的主要原因之一[2]。麻疹病毒(MV)感染的实验室诊断“金标准”是检测到麻疹特异性IgM [3]，可采用捕获法ELISA或是免疫荧光法检测，在1个月内未接种过麻疹减毒活疫苗而在血清中查到麻疹IgM抗体作为麻疹实验室诊断标准之一 [4]。WHO推荐采集临床可疑麻疹病例血清标本检测IgM 和尿液标本、鼻咽标本检测麻疹病毒基因组[5]，前者用于证实急性麻疹感染的诊断，而后者确定病毒基因型。因此，临床和流行病学迫切需要一种快速、廉价、和准确检测MV-IgM抗体的诊断试剂盒。我们通过应用麻疹减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠，制备MV 的McAb，并用其成功地研制了捕获法检测抗MV-IgM的ELISA试剂盒。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 杂交瘤建株 MV减毒活疫苗株(上生®国药准字S10820293，产品批号：2004012403)；羊抗小鼠IgG-HRP(上海生物制品研究所产品)；8周龄雌性Balb/c小鼠购于上海复旦大学实验动物科学部 (SCXK沪2002-0002)；SP 2/0骨髓瘤细胞和其他材料为本室原有。
1.1.2 乙型脑炎病毒(JEV)减毒活疫苗和灭活甲型肝炎病毒细胞培养抗原 JEV减毒活疫苗为成都生物制品所产品(蓉生®国药准字S10900004，批号20041289-1)，FRhK4细胞培养甲肝病毒抗原由本室制备并灭活。
1.1.3 质控血清 抗甲型肝炎病毒-IgM(抗HAV-IgM)、抗乙脑病毒-IgM(抗JEV-IgM)、抗乙型肝炎病毒核心抗原-IgM(抗HBc-IgM)、抗巨细胞病毒-IgM(抗CMV-IgM)、抗EB病毒-IgM(抗EBV-IgM)阳性血清各6份和类风湿因子(RF)阳性血清10份均来自本中心检验科。用德国维润赛润生物有限公司抗MV-IgM试剂盒检测为阳性和阴性各15份标本作为标准阳性和阴性对照品。
1.1.4 临床血清标本 39例临床疑似麻疹患者的血清56份(7例具有双份或3份血清)系本中心2006年采集。
1.1.5 同类商品试剂盒 同类捕获法检测抗MV-IgM ELISA商品试剂盒为珠海海泰生物制药有限公司产品(批号060501)。
1.2 方法
1.2.1 分泌抗MV杂交瘤细胞株的建立 以MV减毒活疫苗株腹腔免疫Balb/c雌性小鼠，4周后加强免疫，3 d后取脾细胞与SP 2/0细胞融合，方法参照文献[6] 。以ELISA法筛选分泌抗MV的阳性杂交瘤细胞，按有限稀释法连续克隆3次纯化后，注入用降植烷预处理过的Balb/c小鼠腹腔，10 d后抽取腹水鉴定。
1.2.2 抗MV McAb的滴度和特异性鉴定 以ELISA测定腹水中杂交瘤细胞的抗麻疹病毒抗体滴度，并用JEV减毒活疫苗、灭活甲肝细胞培养抗原和SP 2/0细胞培养液(阴性对照)替代麻疹减毒活疫苗鉴定MV McAb的特异性。
1.2.3 抗MV-酶结合物的制备 以辣根过氧化物酶标记纯化的自行制备的抗MV-单克隆抗体IgG。
1.2.4 ELISA检测抗MV-IgM试剂盒的制备 以本室自制的抗MV -酶结合物和经灭活的MV疫苗细胞培养抗原，分别作为捕获法ELISA法实验中的酶结合物和抗原，再经实验对试剂盒中其他组分的参数进行调整。
1.2.5 血清抗MV-IgM检测 ①自制试剂盒：以1∶100稀释的上述临床疑似麻疹血清标本50 μL，加入包被抗μ链的微孔板孔内，同批分别设置阴、阳性和空白对照孔。37℃温育1 h，洗板，加入用MV和抗MV-酶结合物制备的免疫复合物，各孔50 μL。37℃孵育1 h，再次洗板，加入四甲基联苯胺(TMB)底物显色，再经37℃温育10 min，加浓度为2 N的硫酸终止液终止反应后，用酶标仪读取A值。结果判定：S(样品)A值/ 临 界 值(cutoff)≥1判为阳性。其中临 界 值=阴性对照平均A值×2.1(阴性对照平均A值<0.05时，按0.05计算)。② 同类商品试剂盒：同类的海泰公司试剂盒，按操作说明书进行检测。
1.2.6 试剂盒特异性鉴定 自制试剂盒检测抗MV-IgM阳性血清的同时，以上述抗HAV-IgM、抗JEV-IgM、抗HBc-IgM、抗CMV-IgM、抗EBV-IgM阳性血清各6份及RF阳性血清10份，替代抗MV-IgM阳性标本，以鉴定其特异性。
1.2.7 试剂盒稳定性观察 将自制试剂盒放置37℃ 3 d，并与4℃保存的试剂盒平行检测临床血清的抗MV-IgM。
2 结果
2.1 分泌抗MV杂交瘤建株情况
细胞融合一次成功，ELISA筛选出11个强阳性孔，连续克隆化培养3次后，获得3株稳定分泌抗MV的杂交瘤细胞。经液氮冻存3个月后，细胞复苏传代生长良好，抗体滴度稳定。随即用以制备富含单抗的Balb/c小鼠腹水，供进一步鉴定。
2.2 抗MV-McAb滴度和特异性
经ELISA检测，杂交瘤细胞中一株名为B2者所产生的腹水抗MV-McAb滴度 ≥1∶1 000 000。该株抗MV McAb能与MV减毒活疫苗发生特异性反应，而与JEV减毒活疫苗、灭活的甲肝抗原和 SP 2/0细胞均无交叉反应。
2.3 对本室捕获法ELISA抗MV-IgM试剂盒的考核
2.3.1 试剂盒的特异性 B2株抗MV McAb制备的酶结合物，在捕获法ELISA检测抗MV-IgM中，能与抗MV-IgM阳性血清标本起反应，但与抗HAV-IgM、抗HBc-IgM、抗JEV-IgM、抗CMV-IgM和抗EBV-IgM阳性血清及RF阳性标本无交叉反应。与德国维润赛润生物有限公司抗MV-IgM试剂盒检测为阳性、阴性各15份标本作为标准阳性和阴性对照品比较，其敏感性和特异性完全一致。
2.3.2 试剂盒的稳定性 将试剂置37℃3 d进行稳定性考核后，与同时放4℃的试剂进行平行检测比较，结果一致。
2.3.3 与同类商品试剂盒检测结果的比较 本室自制的捕获法ELISA抗MV-IgM诊断试剂盒与珠海海泰生物制药有限公司的同类商品试剂盒，对本室2006年收到39例疑似麻疹病例的56份标本进行了比较，其中不符8例的16份血清检测结果见表1。
①为两次检测结果的均值；S/CO值为S(样品)A值/ 临 界 值(cutoff)。本室自制试剂的临界 值=阴性对照平均A值×2.1(阴性对照平均A值<0.05时，按0.05计算)。珠海海泰生物制药有限公司试剂的临界值=阴性对照平均A值×2.1(阴性对照平均A值<0.07时，按0.07计算)。
3 讨 论
尽管使用麻疹减毒活疫苗已有数十年历史，此病仍有流行发生。为控制麻疹流行和实现最终消灭麻疹这一目标，需要敏感、可靠的临床诊断和流行病学监测系统。国外学者最近对RT-PCR、病毒分离和IgM ELISA进行了比较研究，结论是血清学方法就足以实验室诊断麻疹病毒感染。检测单份抗MV-IgM能诊断95%的病人[7]。用IgM捕获法 ELISA检测麻疹病人出疹后4~11 d内采取的标本，100%呈阳性[8]。血清抗MV-IgM检测已成为实验室确认麻疹感染的标准诊断方法之一[4]。
为获得更理想的抗MV-IgM检测诊断试剂，我们用麻疹减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠，成功地制备了数株分泌抗MV单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞，其中B2细胞株分泌的抗MV滴度最高，特异性强，与其他病毒抗原SP 2/0细胞均无反应。用该单抗酶结合物研制的捕获法ELISA检测抗MV-IgM诊断试剂盒，经考核，仅与抗MV-IgM阳性血清发生反应，与HAV-IgM、抗HBc-IgM、抗CMV-IgM、抗EBV-IgM和抗JEV-IgM 阳性及RF阳性血清均无反应，表明高度特异，且与德国维润赛润生物有限公司抗MV-IgM试剂盒检测为阳性和阴性各15份标本作为标准阳性和阴性对照品比较，结果完全一致。表明两者敏感性和特异性相同。
根据中国药品监督管理局的标准，酶联诊断试剂盒在37 ℃的条件下存放3 d可相当于在4 ℃条件下存放半年。我们将该试剂盒在37 ℃条件下，存放3 d后与4 ℃存放的试剂盒平行检测比较，结果证明其稳定性较好，表明可在4 ℃条件下贮存半年。
本室自制抗MV单克隆抗体制备的捕获法检测抗MV-IgM试剂盒，与同类商品试剂盒，对我室2006年收集的临床疑似麻疹病例39例的56份血清标本进行平行检测和比较。结果显示，① 结果一致的有48份，其中18份阴性，30份阳性；② 不符的有8例，其中6例的首份血清，本室自制试剂盒检测阳性，商品试剂盒为阴性，而这6例的第2份血清，两种试剂盒检测均为阳性。③ 1例仅有首份血清，本室试剂盒检测处于临界值，该商品试剂盒检测为阴性，由于缺乏第2份血清，是否为麻疹，难以判定。④ 另有1例收集了3份血清，两种试剂盒检测首份均为阴性，第3份均为阳性；第2份血清本室试剂盒检测阳性，该商品试剂盒为阴性。结果表明，本中心研制的抗MV-IgM检测试剂盒的敏感性好，其检出麻疹病人血清抗MV-IgM的时间可以提前。这将有利于于临床诊断和流行病学监测，更早进行必要的病人隔离和治疗，以防麻疹病毒的大面积传播。
本实验表明，用麻疹减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠制备抗MV McAb是可行的，用所获这种抗MV McAb研制捕获法ELISA检测抗MV-IgM试剂盒，其敏感性、特异性和稳定性均令人满意。
4 参考文献
[1]World Health Organization. WHO-UNICEF joint statement on strategies to reduce measles mortality worldwide. Wkly[J]. Epidemiol Rec，2002，77(27)：224–228.
[2]Centers for Disease Control and Prevention. Progress in reducing measles mortality—worldwide，1999–2003. Morb . Mortal. Wkly. Rep，2005，54：200–203.
[3]Grandien M，Osterhaus ADME，Rota PA，et al. Laboratory diagnosis of measles infection and monitoring of measles immunization：memorandum from a WHO meeting[J]. Bull.WHO 1994，72：207-211.
[4]GB 15983—1995.麻疹诊断标准及处理原则[S].
[5]World Health Organization. Mortality reduction and regional elimination：strategic plan 2001–2005，global measles[M]. Geneva：2001.
[6]顾方舟，曹逸云，董德祥，等译. 病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术[M]. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993，561-570.
[7]El Mubarak HS，Van De Bildt MW，Mustafa OA，et al. Serological and virological characterization of clinically diagnosed cases of measles in suburban Khartoum[J]. J Clin Microbiol，2000，38(3)：987–991.
[8] Helfand RF，Heath JL，Anderson LJ，et al. Diagnosis of measles with an IgM capture EIA：the optimal timing of specimen collection after rash onset[J]. J Infect Dis，1997，175(1)：195–199.
(收稿日期：2008-02-25)