【摘 要】目的：研究三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2基因（ABCG2）第5外显子单核苷酸多态性C421A位点与中国闽南地区人群原发性痛风发病的相关性，为闽南地区人群痛风的早期诊断筛选合适的遗传标记。方法：采用改进的三引物法对154例痛风患者和160例健康志愿者的外周血样本进行扩增检测，利用统计学分析SNP位点（rs2231142）的基因型携带频率、相对危险度及与闽南地区人群痛风发病相关性。结果：痛风患者AA型携带频率为18.80 %，而正常人群中为8.12 %，痛风患者的AA基因型和A等位基因携带频率明显高于正常人群。P<0.01；痛风患者AA型携带频率为43.52 %，而正常人群中为23.44 %，P<0.01。rs2231142位点多态性与痛风发病显著相关（F值为31.97，P<0.01），AA型携带者与CC基因型相比，发病风险提高了4.397倍，经校正后为4.371倍； A/C杂合型携带者发病风险提高了3.250倍，校正后为2.879倍；A等位携带者发病风险与C等位基因相比提高了2.516倍。另外rs2231142位点的多态性对收缩压、舒张压以及血尿酸、尿尿酸、C–反应蛋白、甘油三脂、尿素氮、肾结石等生化指标检测值有显著影响。结论：ABCG2 基因上单核苷酸多态性位点rs2231142与闽南地区人群痛风发病有很大相关性，可以作为闽南地区人群痛风早期诊断的一个遗传标记。
【关键词】 痛风；单核苷酸多态性；rs2231142；三引物法；早期诊断
痛风是一种单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及（或）尿酸排泄减少所致高尿酸血症直接相关，属于代谢性风湿病范畴，流行病数据表明，近年来我国人民由于生活水平提高和生活习惯改变，痛风发病率急剧升高，并呈现低龄化趋势[1]。研究表明，遗传因素是痛风发病的一个重要因素，三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2基因（ATP-binding cassette，subfamily G（WHITE），member 2；ABCG2）是一种ATP结合转运蛋白，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织，其功能异常可导致尿酸排泄能力下降[2]。目前认为ABCG2基因上单核苷酸多态性在这一过程中起了重要作用，其中（single nucleotide polymorphism，SNP，rs2231142，）C421A（rs2231142）位点与痛风发病相关性最大，能够解释10 %～29 %的痛风发病[3]。ABCG2基因单核苷酸多态性在闽南地区人群中研究还未见报道，本文采用改进的单引物等位基因特异性扩增方法，不经过基因提取，直接对154例痛风患者和160例健康志愿者的外周血样品进行扩增检测，并分析rs2231142位点基因型与痛风发病相关性，为痛风的预防控制和治疗提供参考。
1 实验样本
所有的基因组样本均来自福建省泉州市正骨医院痛风患者及健康志愿者，年龄17～78岁，平均（64±14）岁。痛风组154例，为2010年7月至2011年12月福建省泉州市正骨医院门诊和住院的痛风患者，均符合1977年美国风湿病协会制定的痛风性关节炎诊断标准。对照组160例，为2010年7月至2011年12月福建省泉州市正骨医院日常体检等健康志愿者，排除痛风、高尿酸血症、高脂血症、高血压、冠状动脉硬化性心脏病、糖尿病、恶性肿瘤等疾病。
2 试验方法
2.1 引物设计 本文主要检测人群ABCG2基因rs2231142位点基因型，SNP位点附近的相关基因序列从NCBI获得，引物设计使用Primer 5.0软件，Tm值计算采用网上软件工具OligoAnalyzer 3.0[4]；为增加检测的特异性，引物3′端倒数第3个碱基引入了错配碱基，见表1。
2.2 血液样本与基因组的获得与保存 用EDTA（或柠檬酸钠）抗凝管抽取实验对象的外周静脉血5 ml（在知情同意的前提下，获取患者和志愿者的血液样本）置4 ℃保存备用。取200 μl外周血样本，用全血DNA提取试剂盒（Beijing Sunbiotech Co.td）按说明书提取基因DNA，TE缓冲液溶解，并将其浓度调整为50 ng·μl-1，置4 ℃保存备用。
2.3 三引物SNP基因型特异性扩增 扩增体积25 µl，包括1.5 mmol·L-1的MgCl2、0.25 mmol·L-1的dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶（大连TaKaRa公司生产），0.4 µmol·L-1的P142FW，0.4 µmol·L-1的P142RN（每个样品需要两管PCR进行反应，内引物分别为P142RN1和P142RN2）， 2.5 ml10×PCR buffer（50 mmol KCl、15 mmol TrisHCl、pH 8.0，TaKaRa公司，大连），1 µl基因组模板。将上述各试剂加入200 ml规格的PCR管中，按下述程序进行PCR操作，95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，57.3 ℃ 35 s，72 ℃35 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保持。
2.4 全血PCR扩增 扩增体积25 µl，包括0.25 mmol·L-1的dNTPs、1.0 U Taq DNA 聚合酶（TaKaRa公司，大连），0.4 µmol·L-1的P142FW，PN1的浓度为0.4 µmol·L-1的P142RN（每个样品需要两管PCR进行反应，内引物分别为P142RN1和P142RN2），2.5 ml10×PCR buffer（全血扩增缓冲液，HpH buffer[5]），0.7 µl外周血样品。将上述各试剂加入200 ml规格的PCR管中，按下述程序进行PCR反应：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57.3 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35个循环；然后 72 ℃ 10 min；4 ℃ 下进行保持。
2.5 电泳检测 对所有PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析：取7 µl PCR产物，混合1.5 µl 的6×loading buffer，2 %琼脂糖电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电压100 v，电泳时间10 min；琼脂糖凝胶采用GoldView核酸染料染色（5 μl·100ml-1），凝胶成像仪观察结果并拍照，记录并分析相关基因型。
2.6 相关生化指标检测 采用全自动生化分析仪对所选人群的与痛风发病相关的血尿酸、尿尿酸、血沉、C–反应蛋白、血甘油三酯、血胆固醇、尿素氮、肌酐等进行检测，同时还测量血糖、收缩压、舒张压、肾结石等指标，根据肾结石大小和分布将其量化，其中未见明显异常为1，单侧肾脏出现结石为2，双侧结石为3。
2.7 统计分析 将痛风患者和健康志愿者按年龄分为3组，对获得的实验数据进行整理，SNP的hardy–weinnerg平衡采用在线工具进行计算，采用SPSS17.0 数据分析软件对获得的数据进行分析和处理（P<0.05为显著性差异），各等位基因的相对危险度（odd ratio，OR）值通过非条件Logistic回归法计算OR的比值比和95 %的可信区间[6]，并经年龄、甘油三酯等因素校正。根据以上结果分析泉州地区人群痛风相关的rs2231142位点基因性型的与闽南地区人群痛风发病的相关性。
3 结 果
3.1 引物设计与全血扩增 有关rs2231142位点的扩增引物如下表，为了增强三引物法扩增特异性，等位基因特异性内引物（rs142PRN1，rs142PRN2）倒数第3位引入了错配碱基。本研究采用华东医学技术研究所研制的全血扩增缓冲液（HpH buffer）[5]，结合本课题发展的三引物扩增法，随机选用不同基因型的样品（痛风患者），按上述试验方法进行扩增，检测结果如图1所示，外周血样本与经提取基因组样本扩增结果一致，扩增效率相近，证明直接对外周血进行三引物法PCR进而检测其SNP基因型是可行的。从图1还可以看出，样品A基因型为（A/C），样品B为（AA）型。说明泳道1～2提取基因组样品A扩增电泳结果；泳道3～4EDTA抗凝剂处理外周血样品A直接扩增电泳结果；泳道5～6柠檬酸钠抗凝剂处理外周血样品A直接扩增电泳结果；泳道7～8EDTA抗凝剂处理外周血样品B直接扩增电泳结果。
图1 不同方式处理的样品三引物法检测ABCG2基因SNP位点（rs2231142）结果图
3.2 SNP位点（rs2231142）基因型分布与痛风发病相关分析 依据笔者建立的三引物等位基因特异性扩增法，对154例痛风患者和160例健康志愿者进行SNP分型检测，对所测得数据进行Hardy-Weinberg平衡分析，结果显示，对照组P=0.063567；痛风组P=0.706304，均符合Hardy-Weinberg平衡分析。为了进一步分析ABCG2基因SNP位点（rs2231142）基因型与闽南地区人群痛风发病的相关性，我们对所检测到的rs2231142位点不同基因型做了基本统计分析和OR值计算，其中OR校正因子为年龄、尿尿酸、C-反应蛋白、甘油三脂、尿素氮、收缩压、舒张压、肾结石等因素。
结果如表2所示，rs2231142位点AA基因型，在痛风组中分布频率为18.18 %，对照组中为8.12 %；A/C杂合型基因型在痛风组中携带频率为50.65 %，对照组为30.63 %；CC基因型，在痛风患者中携带频率为31.16 %，对照组为62.51 %，各基因型携带频率在痛风患者和健康人群之间有显著性差异（P<0.01）。rs2231142位点等位基因A在痛风患者中携带频率也远高于正常人群（分别为43.52 %和23.44 %， P≤0.01）。经过分析，rs2231142位点AA基因型携带者痛风发病风险提高了4.397倍，A等位携带者发病风险与正常C等位基因携带者相比提高了2.516倍。这些均揭示了rs2231142与泉州地区人群原发性痛风具有相关性。
为了验证rs2231142位点与其他痛风相关的生化指标是否有关联性，将rs2231142基因型与相关生化指标进行了单因素方差分析，结果如表3所示，rs2231142多态性与血尿酸、C-反应蛋白、甘油三酯、收缩压、舒张压、肾结石等生理生化指标具有相关性，具体机理则需要开展进一步实验及相关研究。
4 讨 论
rs2231142，又称Q141K或C421A，是一个在ABCG2基因第5外显子的SNP，Owen等[2]实验证实ABCG2作为一种转运蛋白及尿酸分泌蛋白定位于细胞膜，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织，在14783名受试者中进行ABCG2单核苷酸基因多态性分析，发现rs2231142多态性的存在与血清尿酸浓度密切相关。C421A引起ABCG2蛋白141位谷氨酰胺转变为赖氨酸（Q141K），使尿酸的转运速率下降53 %[7]，从而导致血尿酸水平升高，影响痛风的发生，约有10 %的白人痛风病案与C421A缺失突变相关。在采用基因组关联法对7699例（Framingham）和4148例（Rotterdam cohort）以及4000例非裔美国人研究后，得出其odds ratio为1.74，其中AA型更被认为是导致痛风的原因，而杂合型AC也增加了1.7倍患病风险[8]。Kazumasa等[3] 在3925名年龄在40～90岁的日本人中，分析了rs2231142多态性与血清尿酸浓度及高尿酸血症和痛风的关系，证明两者具有密切相关性并可解释29 %的痛风发病原因。Wang Binbin、李发贵等 [9，10]通过对不同地区汉族人群ABCG2基因的rs2231142位点基因型携带规律的研究，发现中国汉族男性人群中rs2231142位点AA基因型的携带者痛风发病率远高于CC基因型携带者，表明rs2231142位点多态性与中国汉族男性原发性痛风的发病密切相关。因此可以说rs2231142多态性位点是一个重要的痛风发病遗传标志，但其在闽南地区人群中还未做充分研究。
本研究以314例闽南人群样本为研究对象进行分析，发现ABCG2基因上的rs2231142位点，痛风患者携带高风险基因型（A/C、CC型）的比率为68.83 %，正常人群中为仅为38.75 %；而且rs2231142位点各基因型在正常人和痛风患者携带频率均有显著性差异（P<0.01）。根据本研究对发病风险分析结果，AA基因型携带者痛风发病风险提高了4.397倍，A等位携带者发病风险与正常C等位基因携带者相比提高了2.516倍。因此将rs2231142作为对闽南地区人群进行痛风筛查的一个遗传标记对于痛风早期诊断和发现有很大参考意义。另外，我们还发现ABCG2 基因的rs2231142位点多态性还影响到收缩压、舒张压以及血尿酸、C-反应蛋白、甘油三酯、肾结石等指标，这与实际临床痛风患者临床表征相符，痛风患者常合并糖、脂等物质代谢紊乱，肾结石和高血压也出现的较多，但其中遗传及分子机制还需要进一步研究。
本研究采用了一种简便、准确和低成本的三引物法检测痛风相关基因的SNP的方法，仅用一条外引物和两条序列一样的内引物（仅3′端第一个碱基为等位基因特异性碱基），虽然需要两管PCR反应，但这种方法对大部分样品，特别是对于模板量变化不定的全血PCR扩增而言，重复性好，操作简便，易于实现，经改进和完善后适于在普通医疗机构临床使用。
5 参考文献
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