摘要：目的 探讨缓衰口服液对动脉粥样硬化性肾动脉狭窄（ARAS）小鼠肾脏低氧-微血管荒废-肾间质纤维化病理过程的影响机制。方法 通过对ApoE-/-小鼠喂以高脂饲料，并行左侧肾脏切除术，建立ARAS动物模型。手术2周后，将模型小鼠随机分为缓衰口服液组（中药组）、模型组，另设空白组（C57BL/6J小鼠）。中药组用缓衰口服液0.01 mL/（g·d）灌胃，空白组和模型组予0.01 mL/（g·d）生理盐水灌胃。给药12周后，取材，检测肾功能，Masson染色观察肾间质纤维化程度，免疫组化法检测各组小鼠肾脏Ⅳ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）、血管性血友病因子（vWF）的表达，RT-PCR检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和转化生长因子-β（TGF-β）的表达情况。结果 与空白组比较，模型组小鼠肾功能不全明显，肾动脉狭窄严重，肾间质纤维化明显，HIF-1α、TGF-β、Ⅳ型胶原和α-SMA表达明显增加（P<0.05），vWF表达明显减少（P<0.05）；与模型组比较，中药组HIF-1α、TGF-β、Ⅳ型胶原和α-SMA表达明显减少（P<0.05），vWF表达明显增加（P<0.05）。结论 缓衰口服液对ARAS小鼠的肾功能和肾间质纤维化有明显改善作用，该作用可能与其对缺血性肾脏HIF-1α和TGF-β表达的抑制有关。
关键词：动脉粥样硬化性肾动脉狭窄；缓衰口服液；肾间质纤维化；低氧；小鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0053-05
基金项目：国家自然科学基金（81141122）
通讯作者：饶向荣，E-mail：Raoyisheng@163.com
动脉粥样硬化性肾动脉狭窄（atherosclerosis renal artery stenosis，ARAS）发生发展过程中，肾脏血流量减少致局部组织缺血缺氧，进而激活低氧诱导因子（HIF）-1α、转化生长因子（TGF）-β，导致肾小管、血管内皮损伤，加速间质纤维化进程。现代研究表明，低氧是导致肾小管-间质纤维化的重要因素。微血管重塑与肾脏瘢痕形成相关，是ARAS进展的重要环节之一。肾脏微血管床丢失，使位于该区域周围的细胞处于相对缺氧，产生促纤维化反应，导致更多的微血管阻塞，形成缺氧-微血管堵塞-缺氧这样的恶性循环[1-2]。现代研究表明，缺氧对肾脏的损害主要是通过HIF-1α介导的[3]。ARAS发展过程中，HIF-1α和TGF-β随着缺氧的加重表达增多，导致肾间质纤维化，肾间质纤维化是ARAS发展到终末期肾病的关键病理环节[4]。本研究旨在研究缓衰口服液对ARAS关键的病理环节——低氧导致的微血管荒废和肾小管间质纤维化的影响机制，探讨缓衰口服液在治疗ARAS中的作用。
1 实验材料
1.1 动物与饲料
15周龄雄性SPF级ApoE基因缺陷小鼠40只，SPF野生型C57BL/6J小鼠20只，体质量均为20 g，北京大学医学部实验动物中心提供，合格证号：SCXK（京） 2011-0012。高脂饲料，北京科澳协力饲料有限公司。
1.2 药物与主要试剂
缓衰口服液，中国中医科学院广安门医院药剂科提供，浓度为1.6 g/mL，由黄芪、太子参、当归、川芎、赤芍、益母草、白芍、茯苓、泽泻、车前草、鸡血藤、生大黄组成，批号20120711。兔抗大鼠Ⅳ型胶原单克隆抗体（货号BA2174），血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）抗体，货号BA0046，武汉博士德生物工程有限公司；HE染色液：苏木素染液，0.5%盐酸酒精，氨水，0.5%伊红液，北京迈新公司。引物采用premier5.0设计，北京赛百盛公司合成。Masson染色液：高碘酸溶液，雪夫试剂，Mayer苏木素（规格：3×100 mL/套），北京益利精细化学品有限公司；Trizol试剂，Invitrogen生物科技公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂，Applied Biosystems公司，批号43049155。
1.3 主要仪器
TGL-16G高速台式离心机（重庆市医药股份医疗器械公司），自动脱水机（Leica ASP200S），全自动HE染色机（MICROM HMS760X），病理切片机（德国，Leica RM2245），AU2700全自动生化测试仪（OLYMPUS公司），核酸紫外分光光度计（德国Biophotometer），实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司），电泳仪（北京六一仪器厂OYY-Ⅲ-5型）。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[5]方法，单侧肾切除加高脂饲料喂养，小鼠术前12 h禁食，自由饮水，4%水合氯醛（0.1 mL/ 10 g）腹腔注射，麻醉，俯卧固定，背部备皮、消毒，沿脊柱左侧旁开0.5～0.8 cm、中下1/3处切开皮肤，逐层暴露左侧肾脏，剥除肾包膜，结扎肾动脉和输尿管，切除左肾。缝合前腹腔注射青霉素（0.72万U/g）。手术后将小鼠置于35 ℃恒温箱内，待其完全苏醒后，放回鼠笼。分别于术后4、8、10、12周每组各随机抽取1只小鼠断脊处死，留取肾脏组织和肾动脉标本进行模型评价。
2.2 分组与给药
手术2周后将模型小鼠随机分为缓衰口服液组（中药组）及模型组，开始给药，共给药12周。另设空白组即野生型小鼠未行肾脏切除术。中药组予缓衰口服液0.01 mL/（g·d）灌胃（根据前期预实验结果，相当于成人剂量的20倍），空白组和模型组予生理盐水0.01 mL/（g·d）灌胃，每日2次。
2.3 血液、肾动脉及肾脏标本采集
给药12周后，所有小鼠摘除眼球取血0.1 mL， 3000 r/min离心10 min，取血清，测定血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）。断脊处死小鼠，于腹主动脉开口处切取肾动脉上端，于肾门处分离肾动脉和肾脏，将标本放入10%福尔马林液中固定，行常规石蜡包埋及病理切片。每只小鼠右肾沿冠状面切开，一半放入10%福尔马林液中固定，行病理切片，另一半迅速放入液氮中固定，待做RT-PCR。
2.4 肾动脉HE染色与肾间质Masson染色
肾组织用4%中性甲醛固定后常规脱水，包埋，制成3 μm厚石蜡切片，肾动脉行HE染色，肾间质行Masson染色，光镜下观察肾动脉和肾间质纤维化情况。
2.5 免疫组化观察肾脏Ⅳ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白及血管性血友病因子表达
肾脏标本脱水、浸蜡，石蜡包埋。以3 μm厚度切片，每种抗体免疫组化各2份。步骤：酶封-抗原修复-血清封闭-滴加一抗[按1∶100加入α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体、兔抗大鼠Ⅳ型胶原单克隆抗体、兔抗人vWF多克隆抗体]-滴加二抗（按1∶200加入抗兔IgG抗体——HRP多聚体）-增敏二氨基联苯胺（DAB）显色液显色-复染核-封片。以胞浆出现棕黄色着色为阳性结果。
采用盲法评价：每张切片选5个肾皮质高倍视野（×200），采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析肾脏中α-SMA、vWF和Ⅳ型胶原的表达，测每个视野的阳性染色面积百分比和光密度值，计算平均光密度值（光密度值/阳性面积）[6]。每张切片的阳性面积百分比和平均光密度值取5个视野的平均值，进行半定量分析。
2.6 低氧诱导因子及转化生长因子基因表达检测
用Trizol提取制备总RNA，紫外分光光度计260 nm处测定OD值，测定RNA浓度。引物由premier5.0设计软件设计，序列如下。β-actin（263 bp）上游引物：5"-GCCCAGAGCAAGACAGGTAT-3"，下游引物：5"-GGCCAT CTCCTGCTCGAAGT-3"；HIF-1α（126 bp）上游引物：5"-CAAGATCTCGGCGAAGCAA-3"，下游引物：5"-GGTGAG CCTCATAACAGAAGCTTT-3"；TGF-β（131 bp）上游引物：5"-TCTACAACCAACACAACCCG-3"，下游引物：5"-TTG GACAACTGCTCCACCTT-3’。
总RNA经反转录酶M-MuLV Reverse Transciptase催化合成cDNA，用SYBR Green PCR Master Mix试剂和实时荧光定量PCR仪进行扩增。PCR反应结束后，取PCR产物10 μL进行电泳鉴定，于1.5%琼脂糖凝胶、100 V/cm凝胶的电压下电泳。计算样本中mRNA的相对表达量：ΔCt（目的基因）=目的基因Ct-内对照基因Ct，ΔΔCt=ΔCt（目的基因）-ΔΔCt（对照组均值），目的基因的相对拷贝量为2-ΔΔCt[7]。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 缓衰口服液对小鼠肾功能和血脂的影响
与空白组比较，模型组小鼠Cr、BUN、TC、TG明显增高（P<0.05），中药组Cr、TC明显增高（P<0.05）；与模型组比较，中药组Cr、TG明显降低（P<0.05），见表1。
4.2 病理观察结果
4.2.1 肾动脉病变情况 手术8周后模型组小鼠动脉内膜出现粥样硬化样改变，手术10周后见明显肾动脉斑块形成，手术13周后肾间质出现大量炎性细胞浸润，并有纤维化形成。空白组动脉内膜光滑，未见病理改变；模型组血管内大量粥样斑块形成；中药组动脉内膜有少量粥样斑块形成，部分内皮下有炎性细胞浸润。见图1。
4.2.2 肾组织Masson染色 空白组肾间质无肾小管萎缩及间质纤维化，肾小管排列紧密，无炎症细胞浸润；模型组肾间质可见大量炎症细胞灶状分布，肾间质纤维化较明显；中药组肾间质可见少量炎性细胞呈灶状分布，肾间质纤维化不明显。见图2。
4.2.3 缓衰口服液对肾间质毛细血管荒废和肾间质纤维化的影响 空白组间质毛细血管丰富，模型组肾小管间质毛细血管稀疏，荒废明显，中药组毛细血管较正常组有所荒废，但较模型组明显减轻。见图3。与模型组比较，中药组vWF相对表达量增加及Ⅳ型胶原、α-SMA相对表达量均明显减少（P<0.05），见表2。
4.3 缓衰口服液对小鼠肾脏组织转化生长因子-β和低氧诱导因子-1α基因表达的影响
5 讨论
本研究对ApoE基因缺陷小鼠行单侧肾脏切除加高脂饲料喂养建立ARAS动物模型。ApoE基因缺陷小鼠作为动脉粥样硬化的理想模型已经广泛运用于实验研究，该模型小鼠肝脏摄取富含三酰甘油脂蛋白（TRL）障碍，引起TRL在循环中存留，致TG和TRL升高及严重广泛的动脉粥样硬化病变[8]。以往报道该型小鼠在普通饲料喂养下，25周出现肾动脉内膜增生，30周有肾动脉斑块形成，32周有斑块破裂，并出现肾小管周围毛细血管减少[9]。国外有文献报道对8周龄雄性ApoE-/-小鼠5/6肾脏切除，在25周龄出现明显肾动脉狭窄[5]。进行大部分肾脏切除造ARAS模型，最初由于有效肾单位减少，血流对残余肾血管的剪应力变大，血管局部机械损伤加强。此后随着慢性肾脏病（CKD）的进展，进一步加速动脉粥样硬化的进展。研究表明，在CKD患者中，存在着炎症-内皮损伤-血小板活化的病理过程。该过程中氧化应激反应增加导致了血管内皮损伤，以致血管内皮功能受损，从而影响一氧化氮对血管功能的调节和内皮损伤后的修复[10]。鉴于实验成本和既往对该型小鼠的不同造模方法的评估，我们决定行单侧肾脏切除加高脂饲料喂养造模。
本研究发现缓衰口服液能明显延缓动脉粥样硬化斑块的形成，对微血管荒废表现出明显抑制性，并且能明显下调介导低氧损伤的HIF-1αmRNA和其下游促纤维化因子TGF-βmRNA水平，同时对肾脏间充质转换的标记物α-SMA和Ⅳ型胶原的表达呈现出明显的抑制作用。ARAS以脾肾不足、气血亏虚为主要病因，“因虚致瘀”和“久病入络”为基本病机，痰湿、瘀血为主要病理产物，治疗多采用益气活血、利湿泄浊的方法[11-12]。缓衰口服液正是针对ARAS多虚多瘀特点而治疗。方中生黄芪、太子参益气，充达气血生化之源；当归、赤芍活血养血；川芎行气；茯苓、泽泻、白术、车前草利水渗湿。诸药合用，共奏益气、活血、祛湿之功效。既往研究表明，该方能减轻5/6肾切除造模大鼠残余肾细胞外基质（ECM）的积聚，抑制促纤维化因子TGF-β在残余肾的表达，改善肾小球硬化和抑制肾小管-间质纤维化程度，减轻肾内微血管丢失[13]。
目前西医治疗ARAS主要是控制血脂、血压、抗血小板聚集等，用肾素-血管紧张素系统阻滞剂防治肾间质纤维化，该类药物对肾功能不全引起的蛋白尿有一定的降低作用，并通过抑制血管收缩作用改善肾间质缺血情况。但是对于血清肌酐明显升高的患者，该类药物的应用明显受到限制，且血管重建和支架植入术对肾功能改善未见明确疗效[14-15]。因此近年来中医药在延缓ARAS进展和保护肾功能方面的作用日益受到重视。
本研究检测HIF-1α、vWF、TGF-β、Ⅳ型胶原、α-SMA的表达，观察中药在低氧-微血管荒废-肾间质纤维化中的作用。结果表明，缓衰口服液能抑制ARAS中低氧-微血管荒废-间质纤维化这一病理链的进展。有研究表明，肾小球疾病中肾小管-间质纤维化的程度与肾小管周围毛细血管数量及面积呈负相关，肾小管-间质纤维化伴随着肾小管周围毛细血管的荒废及毛细血管血流的减少[16]。因此，缺氧被认为是肾小管-间质损伤的主要因素，是早期纤维化的信号，并贯穿肾纤维化的整个过程，最终导致终末期肾脏病。HIF-1是机体在低氧环境下最主要的调控因子。组织的缺氧会促进细胞保护因子如HIF等的产生。HIF-1是由α、β两个亚基组成的异二聚体，其核心HIF-1α受缺氧信号的调控。在缺氧情况下，胞质内的HIF-1α转移到核内与HIF-1β结合形成有活性的HIF-1，HIF-1与目标基因的缺氧反应元件结合位点结合，促进其转录[17]。肾脏短暂缺氧会诱导HIF-1α的表达以达到适应，但是长期慢性缺氧会导致纤维化的形成[18]。既往的研究表明，该方能减轻5/6肾切除造模大鼠残余肾ECM的积聚，抑制促纤维化因子TGF-β在残余肾的表达，改善肾小球硬化和抑制肾小管-间质纤维化程度，减轻肾内微血管丢失[19-20]。本研究将ARAS过程中的病理链“动脉粥样硬化-低氧/微血管荒废-间质纤维化”作为一个整体来研究，且探讨了该方对TGF-β、HIF-1α等因子的调节作用。
本研究表明，缓衰口服液具有对微血管的保护和抗肾小管间质纤维化作用，其机制可能与抑制HIF-1α及其下游的TGF-β表达有关。然而，本研究尚不能说明缓衰口服液对减少微血管毁损与其对肾动脉的保护作用具有同样的机制。国外研究表明，抑制ARAS模型的尿毒症毒素可以表现出显著的抗动脉粥样硬化作用[5，20]。至于缓衰口服液对ARAS的治疗机制是否与此类似，有待进一步研究。
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（收稿日期：2014-05-02；编辑：华强）