对照品溶液的制备
精密称取8个对照品及内标适量，用20%甲醇溶解制成混合对照品溶液，使对照品的质量浓度分别为10 400，424，344.4，71.2，24，23.4，20.4，118.4 mg·L-1，内标磺胺甲噁唑为 0.525 mg·L-1。将混合对照品溶液用20%的甲醇分别稀释成1∶0，1∶5，1∶10，1∶100，1∶200，1∶500，1∶1 000的系列标准溶液。同时将混合对照品溶液用20%甲醇稀释成1∶2.5，1∶20，1∶800的溶液用于制备QC样品。
2.4 广金钱草提取物的制备
取已切碎的广金钱草药材（批号1008016）200 g，加入50%乙醇回流提取3次（1∶15，1∶15，1∶10），每次1 h。第1次提取前浸泡1 h，合并提取液，过滤，回收乙醇并浓缩至20 mL。用外标法测得该提取物中夏佛塔苷、异夏佛塔苷、阿魏酸、甘草素、芹菜素、柚皮素、异鼠李素、异牡荆素的质量浓度分别为1.701，0.386，0.015，0.001，0.024，0.012，0.031，0.234 g·L-1。
2.5 胆汁样品采集与处理
胆汁样品采集：取Wistar大鼠6只，按4 mL·kg-1灌胃给予广金钱草提取液，25%乌拉坦7 mL·kg-1腹腔麻痹，实施胆管插管手术。收集0～1，1～2，2～4，4～6，6～8，8～12，12～24 h的膽汁，-20 ℃冷藏。胆汁样品处理：取胆汁0.4 mL，加甲醇20 μL，内标溶液20 μL，盐酸（0.25 mol·L-1）50 μL，涡旋3 min，再加乙酸乙酯1.2 mL，涡旋5 min混匀，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液1.2 mL。N2吹干，用50%甲醇100 μL复溶，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样分析。
2.6 方法学验证
2.6.1 选择性考察 通过比较实际生物样品，模拟生物样品，空白生物基质来考察内源性物质和代谢产物的干扰。给药后收集的胆汁样品、LLOQ标准添加胆汁样品及空白胆汁的典型MRM色谱图，见图2。结果表明胆汁中的内源性物质和代谢产物均不干扰内标物和待测物测定。
2.6.2 标准曲线和定量下限（LLOQ） 取空白胆汁400 μL，分别加入内标溶液20 μL，系列标准溶液20 μL，盐酸溶液50 μL，按照2.5项下处理，记录内标和待测物的峰面积。以待测物与内标峰面积的比值为纵坐标，以待测物的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。用加权最小二乘法（W=1/χ2）计算回归方程。LLOQ为标准曲线上最低浓度点，连续测定6份。8种待测物的标准曲线和LLOQ见表1。结果各成分相关系数（r）均大于0.991 5，说明大鼠胆汁中8种成分在测定质量浓度范围内线性关系良好。LLOQ的准确度RE和精密度RSD均小于15%。
2.6.3 精密度和准确度 取空白胆汁，分别加入内标溶液20 μL，制备QC样品用的标准溶液20 μL，盐酸溶液50 μL，按照2.5项下处理，记录内标和待测物的峰面积。高、中、低3个浓度的QC样品各平行测定6份，用当日随行的标准曲线测定QC样品的质量浓度，计算日内精密度和准确度。连续进行3 d，分别以当日的标准曲线计算QC样品的质量浓度，计算日间精密度和准确度。日内和日间精密度和准确度见表2。结果表明，胆汁样品中各待测成分日内、日间精密度RSD<15%，准确度RE ±15%，表明本方法准确度高、精密度好，符合要求。
2.6.4 提取回收率与基质效應 按2.6.3项测定低、中、高 3 个浓度的质控样品各6份，记录待测物和内标的峰面积（A）。另外，取空白基质400 μL，按2.5项下处理至N2吹干，精密加入配制质控样品用的标准溶液20 μL和内标溶液20 μL，N2吹干，50%甲醇100 μL复溶，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样分析，记录待测物和内标的峰面积（B）。提取回收率=A/B×100%。取来源不同的6批空白基质各400 μL，按2.6.3项方法测定高、中、低3个浓度时待测物和内标的峰面积（C）。同时测定不含基质时待测物和内标的峰面积（D），计算各分析物与内标的基质因子=C/D×100%，再计算出每一分析物经内标归一化的基质因子与其RSD。胆汁中每种被分析物的提取回收率、经内标归一化的基质因子与RSD见表2。结果表明8种分析物的提取回收率均大于63.2%，经内标归一化的基质因子RSD均小于15%，表明本实验方法的提取回收率较高，并且基质效应不影响胆汁中8种成分的浓度测定。
2.6.5 稳定性 取空白基质，制备高、中、低3个浓度的QC样品，每浓度3份，考察样品在室温下12 h的短期稳定性、-20 ℃储存30 d的长期稳定性、经3次反复冻融循环后（-20 ℃～20 ℃）的稳定性。胆汁的短期稳定性、长期稳定性以及3次冻融循环的稳定性，见表3。结果表明胆汁样品稳定性良好。
2.6.6 稀释可靠性 取空白基质加入高浓度对照品溶液适量配制成待考察样品，用空白基质稀释10，100，500倍，每个浓度平行配制5份，按2.5项下处理，进样分析，并计算准确度与精密度。结果显示，8种待测物浓度的精密度RSD均小于15%，准确度RE -9.7%～12.3%，表明实验过程中稀释样品不影响待测物浓度的测定。
2.7 胆汁排泄动力学特征
按2.5项下操作，测定胆汁样品，并以随行标准曲线计算各时段样品中各待测物的浓度，根据相应时段的排泄体积计算排泄量，以时间点为横坐标，累积排泄量为纵坐标，绘制各成分的累积排泄量-时间曲线，见图3。以时间为横坐标，排泄速率为纵坐标，绘制平均排泄速率-时间曲线，见图4。累积排泄量与给药剂量相比，即得该成分的累积排泄率。在0～24 h 内，大鼠胆汁样品中8种化合物以原型在胆汁中的累积排泄率分别为柚皮素（0.047±0.01）%，阿魏酸（1.145±0.46）%，异牡荆素（0.007±0.004）%，夏佛塔苷（0.998±0.24）%，异夏佛塔苷（0.015±0.01）%，芹菜素（0.043±0.018）%，异鼠李素（0.010±0.006）%，甘草素（0.147±0.075）%。结果表明8种成分在胆汁中的原型排泄率较低，并且不同个体之间差别较大。
3 讨论
本研究将所有待测物在正负离子检测模式下所获得的质谱信息进行比较发现，所有待测物在负离子模式下灵敏度高且稳定，故选择负离子模式进行定量分析。除此之外，对不同的流动相系统进行考察，最终发现在以甲醇-0.01%乙酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱的实验条件下，8种待测分析物能够完全分开，且峰形好，响应值高。因此选择甲醇-0.01%乙酸水溶液为流动相。
本研究结果表明8种成分在胆汁中的原型排泄率均较低。本课题组曾对广金钱草提取物在大鼠体内的药动学进行了研究[7]，8种成分中只获得了夏佛塔苷、异牡荆素、芹菜素和阿魏酸的完整药时曲线，而其他成分可能由于存在较强的首过效应，进入血液循环的量非常少，血浆浓度非常低，在胆汁中主要以代谢产物形式存在，原型较少。文献[7-8]研究表明，阿魏酸比黄酮类消除快，且较容易吸收，可在体内发生广泛的生物转化，生成相应的代谢产物，且与胆汁中的排泄速率相比，阿魏酸在尿液中排泄速率更快，上述原因可导致阿魏酸在大鼠胆汁中排泄速率低、原型累积量少。关于柚皮素已有文献报道[9]，柚皮素在胆汁中主要以代谢产物形式存在，原型较少；在尿液中各代谢产物相对量的总和与原型的相当；粪中的各代谢产物相对量非常低，几乎全部以原型的形式排泄。说明导致柚皮素胆汁排泄率低的原因除首过效应发生代谢外，还有可能是胃肠道吸收不好。芹菜素在胆汁中消除慢、原型排泄量少，排泄速率明显低于尿液，且大部分以结合物形式排出[10-11]，该结论与本实验结果基本一致。有文献表明[12-13]，夏佛塔苷等黄酮苷类化合物在胆汁中的原型排泄率均较低，相同成分在尿液中的排泄率稍高些，排泄物大多为化合物的代谢产物，少数以原型排出，该结果可用来解释本研究中黄酮苷类化合物胆汁中的原型排泄量少的原因。本研究阐述了广金钱草中的7种黄酮和1种酚酸类化合物在大鼠胆汁中的排泄规律，提示其在大鼠体内存在广泛的代谢过程或其他排泄途径，后续可进行进一步的考察与研究。
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[责任编辑 张燕]