学生实验
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）42-0279-03
药物动力学是定量研究药物及制剂在生物体内吸收、分布、代谢和排泄过程动态变化规律的一门科学，对于新药研发、药物新剂型和新制剂设计、药物疗效和不良反应监测以及临床合理应用均具有重要指导意义。药物动力学实验是药动学理论与实践密切相结合的重要组成部分，能使学生巩固课堂教授的理论知识，提高动手能力，培养严谨的独立思考和解决问题的能力，对于提高学生的药学专业素质起着至关重要的作用。原来本实验课程选用的实验是“血药浓度法测定家兔口服阿司匹林混悬剂和片剂后的药动学参数”，该实验存在以下问题：
1.所测定的阿司匹林的代谢物水杨酸的半衰期为5～8小时，根据药动学取样设计的指导原则，取样持续时间应该至少为3～5个半衰期，即最终取样持续时间应该至少为给药后24小时，这对于学生实验来说是非常不方便的。
2.样品处理和测定的方法为将血浆中水杨酸衍生化后再用有机溶剂提取，随后采用荧光分光光度检测方法。该样品处理方法较为繁琐，在处理过程中样品容易发生乳化而导致样品损失;另外由于采用测定的方法为荧光分光光度法，此方法并不具备色谱分离的功能，导致测定方法的专属性不高，准确度差，测得的血药浓度数据进一步进行药动学参数计算时存在很大误差，导致实验结果不可靠。基于此，我们对本科生的药动学实验进行改革，将实验改为“血药浓度法测定家兔口服头孢丙烯胶囊剂和片剂后的药动学参数”，采用头孢丙烯为实验药物，并且建立了操作简单的有机溶剂沉淀法处理家兔血浆样品并采用高效液相（HPLC）-紫外检测器测定血浆中头孢丙烯的测定方法。我们将该方法应用于学生实验，使实验取样时间大大缩短，预处理方法简单，更重要的是所测得的药动学参数更加准确，取得较好的教学效果。
一、实验内容
1.实验药物。实验制剂1：头孢丙烯胶囊;规格：每粒含头孢丙烯250mg;生产厂家：上海普康药业有限公司。实验制剂2：头孢丙烯片;规格：每片含头孢丙烯250mg;生产厂家：中美上海施贵宝制药有限公司
2.实验动物：家兔（性别：雌雄不限，体重2-3Kg左右，同一批家兔体重差异最好不超过0.2kg—0.3kg）
3.实验方法。①给药方案。a.家兔采血方法及血样保存：家兔实验前禁食一天，采血前将其放入兔箱中，待安静后，剪去耳缘侧兔毛，暴露家兔耳缘静脉，用酒精棉球擦拭兔耳缘使血管充盈，选取兔近耳尖耳缘静脉血流交汇处切一小口，干棉球擦拭，滴取空白血约0.5～1.0ml于预加肝素试管中，2500转/分钟离心10分钟，吸取上层约0.2～0.4ml血浆于离心管中，-18℃冰箱保存。b.家兔口服片剂或者胶囊（2片或2粒）：一同学将坩埚钳横插于家兔口内，翻转，将舌头压在坩埚钳下，另一同学用镊子夹住片剂，从坩埚钳的孔中水平送入至咽部，用镊子将片子塞入，片子落入食管，然后用注射针筒灌胃，缓慢给予家兔温水20ml。c.定时采血：两种制剂给药后，分别于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6小时取血约0.5～1.0ml于预加肝素试管中，2500转/分钟离心10分钟，吸取上层约0.3～0.5ml血浆于离心管中，-18℃冰箱保存。②血样测定。a.色谱仪器。日本岛津公司高效液相色谱仪，包括LC-10AT VP泵，SPD-10A VP型紫外检测器，CTO-10A柱温箱及杭州英谱公司HS2000色谱工作站b.色谱条件。色谱柱：采用DIKMAC18色谱柱（200×4.6mm，5μm）;流动相：0.1%三氟乙酸（用三乙胺调至pH2.3）：甲醇=75：25;流速：1.2ml/min;柱温：40℃;紫外检测波长：280 nmc.标准曲线的制备。精密称取头孢丙烯标准品一定量，用水配制成1mg/ml的标准溶液。分别精移取标准溶液适量，用水稀释至含头孢丙烯1，5，10，50，100，200，500μg/ml，分别精密取上述溶液10μl，加入90μl空白兔血浆，然后加入300 μl甲醇（用于沉淀蛋白），涡旋混合10秒，12000转/分钟离心10分钟，取上清液100 μl，然后加蒸馏水100 μl，涡旋混合10秒，微量进样器进样20 μl，采用高效液相-紫外检测，记录峰面积（A），建立A对C（浓度）的标准曲线方程。d.血浆样品的处理与测定。空白血浆或样品血浆室温下解冻，待融化后，精密移取100 μl，加入300 μl甲醇，涡旋混合10秒，12000转/分钟离心10分钟，取上清液100 μl，然后加蒸馏水100 μl，涡旋混合10秒，微量进样器进样20 μl，记录峰面积（A）。将测得峰面积带入标准曲线方程，采用外标法计算血浆样品中头孢丙烯浓度。
二、实验结果
1.专属性考察：在此色谱条件下，头孢丙烯与血浆中内源性杂质均完全分离，峰形尖锐，其保留时间约为9.5分钟，其他均为内源性杂质。考察了6份不同来源的家兔血浆，在所建立的HPLC条件下，血浆中的内源性杂质不干扰头孢丙烯的测定，其典型色谱图见图1。
2.标准曲线的线性：以药物与内标峰面积比值（Y）对药物浓度（C，μg/ml），用线性回归方法拟合标准曲线（加权系数为1/C），结果如下：Y=9876C-243（r=0.9999，n=6），线性范围：0.1～50μg/ml。
3.提取回收率。取空白兔血浆0.5 ml数份，分别加入头孢丙烯标准溶液使血浆中头孢丙烯的浓度分别为0.1，5，50μg/ml，按血样预处理方法处理后作HPLC分析，记录峰面积（A1）。另取0.1，5，50μg/ml头孢丙烯标准液，按照血样预处理方法处理后作HPLC分析，记录峰面积（A2），由两者的比值计算提取回收率，经测定高中低个浓度的提取回收率在93.07% ～99.14%之间，符合提取回收率的要求。
4.方法回收率。取空白兔血浆0.5ml数份，分别加入头孢丙烯标准溶液，使血浆中头孢丙烯的浓度分别为0.1，5，50μg/ml，每一浓度配制5份样品，按血样预处理方法处理后作HPLC分析。将测得的浓度与样品配制的浓度相比，得方法回收率。经测定，高中低浓度的测定值在96.95%～99.92%之间，符合方法回收率的测定要求。
5.批内、批间精密度。配制0.1，5，50μg/ml的标准血样各5管，于同一天以一个批次按血样预处理方法处理后作HPLC分析，计算测定数据的相对标准差，即为批内精密度。以后连续测定5天，每天以一个批次测定上述浓度的样品，计算批间精密度。结果批内精密度和批间精密度均小于3.13%，符合精密度的测定要求。
三、讨论
1.实验药物的选择。经文献查阅，头孢丙烯在体内的半衰期为1～2小时，达峰时间约为1.5小时。根据药动学实验设计原则，取样时间应为3～5个半衰期，因此本实验的取样时间为6小时即可，比原先实验需要24小时的取血时间大为缩短，实际操作性好。
2.样品预处理方法的选择。本实验的样品预处理方法为沉淀蛋白法，操作极为简单，引入误差小，样品的取用量少。而原先样品预处理方法为衍生化后有机溶剂提取法，该方法操作繁琐，在处理过程中样品容易发生乳化而导致样品损失;另外该方法的血浆样品取用量大，实际操作性差。
3.测定方法的选择。本实验中我们开发了测定家兔血浆中头孢丙烯的高效液相色谱测定方法，该方法灵敏、专属、准确性高，药动学参数测定准确。原先实验设计的测定的方法为荧光分光光度法，此方法并不具备色谱分离的功能，导致测定方法的专属性不高，准确度差，测得的血药浓度数据进一步进行药动学参数计算时存在很大误差，导致实验结果不可靠。
经本校2011、2012级本科生的实验教学证明，该实验方法操作性强、实验方法简化、测定结果准确，达到了较好的实验教学目的。
参考文献：
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作者简介：陈钧，男，副教授，博士生导师，复旦大学药学院，药剂学教研室。
通讯作者：王建新，男，教授，博士生导师，复旦大学药学院，药剂学教研室。