摘要 重组工程是近几年来兴起的一种基于体内同源重组的、新型的遗传工程。技术重组系统不需要限制性内切酶和DNA连接酶就可以进行DNA克隆和亚克隆。该技术操作简单，效率较高，可望为功能基因组学研究提供一个有力的工具。就重组工程的分类以及近几年来在基因组研究中的应用和进展做一综述。关键词
重组工程；同源重组；研究进展中图分类号Q81
文献标识码A
文章编号1004-8421(2009)11-164-03
传统的以限制性内切酶和连接酶为基础的DNA重组技术曾经革命性地推动了分子生物学和遗传工程的发展，至今仍然发挥着重要作用。但限制性内切酶的应用有其局限性：①限制性内切酶的酶切位点“限制”了对DNA分子进行随心所欲的切割和连接；②仅能对小于20 kb的DNA片段进行操作，大分子DNA体外操作时容易断裂。另外，PCR扩增长片段DNA时易产生突变，且扩增数十kb的DNA分子也几乎是不可能的，上述问题时常困扰研究人员并导致研究工作的停滞不前。为了尽快利用这些全人类共有的宝贵资源，加速功能基因组学研究速度，迫切需要建立一种能够广泛应用的、进行大通量和快速基因操作的新技术。重组工程技术随着对微生物体内重组机制的研究即应运而生。
重组工程的优势在于能够以精确、高效率、简单、快速的方式完成传统DNA重组技术无法做到的复杂基因操作。由于该技术具有高效率、简单性和应用的广泛
性等独特优点，将来完全有可能取代传统的遗传工程技术。
2 同源重组工程
重组工程可定义为基于噬菌体短同源序列重组功能的遗传工程，或基于同源重组的遗传工程。
重组工程技术相对于传统DNA操作技术的优势表现在几个方面：①操作简便，比体外步骤相对简单；②不受DNA片段长短影响，可操作大到几百kb，小到一个kb的DNA片段；③它不受DNA序列的影响，没有限制性酶切位点都可操纵DNA片段。重组工程技术可精确地在染色体或质粒的任意位置进行操作，为后基因组研究提供了一个有力的武器。
2.1 传统的大肠杆菌体内同源重组
2.1.1 RecA重组。在细菌体内存在着内源性重组体系一RecA重组系统，它包含RecA、RecBCD等在内的一系列酶。RecA蛋白质是同源重组中最重要的蛋白组分之一，它能催化同源联会和链交换反应，而recB、recC、recD基因编码产物构成一个在同源重组中的功能单位RecBCD蛋白复合体。在大肠埃希菌中，RecBCD复合物首先与双链DNA末端结合，同时解旋并在特定位置切割DNA转变为2条单链DNA。RecBCD复合物持续解旋延伸3’一OH单链尾巴，产生一条约数千碱基的3’-OH单链DNA尾巴，RecA和SSB蛋白则促进这一单链侵入到另一个双链DNA分子(由DNA促旋酶协助形成超螺旋)中，被置换的另一条DNA链在RecA和SSB蛋白因子的帮助下与第l条链的单链缺口互补配对。链交联形成的hDNA可以通过RecBCD复合物的解旋作用以及Re-cA和SSB蛋白的链传递作用不断延伸，在此期间Holliday中间体被切开(可能由RecBCD催化完成)，并交换DNA末端形成2对重组分子，之后由DNA聚合酶补平缺口，DNA连接酶修复相应的磷酸二酯键。
2.1.2 Chi位点刺激的重组。Chi位点刺激的重组为在野生型细胞中用线性的双链DNA修饰基因组提供了一条途径，当Chi位点(5’CCTCCTCC3’)整合到线性双链DNA的2个末端时，可保护DNA不被RecBCD消化，并在野生型细胞中为RecBCD介导的重组提供DNA上的活性位点，还可跨越数千碱基的异源序列起作用。Dabert的研究表明，Chi位点刺激的重组可使基因置换的效率提高约50倍，可作为在野生型大肠杆菌或其他生物进行基因打靶的有效方法。
Chi位点刺激的同源重组的主要缺陷是效率很低，即使有长的同源区域仍然需要用正负筛选来寻找稀少的重组子。
2.2 噬菌体编码的重组系统噬菌体编码的重组系统是由噬菌体重组酶基因介导的体内同源重组过程，可有效促进线性DNA分子和染色体问的重组，直接在体内对染色体DNA或载体进行基因敲除、敲入、替换、引入单碱基突变或基因克隆，操作简单、精确、快速，可完成传统DNA重组技术无法做到的复杂基因操作。
重组工程系统包括基于缺陷型λ噬菌体的Red重组系统和原噬菌体Rac的RecE／RecT重组系统。
2.2.1 λ噬菌体的Red重组系统。Yu和Court博士最先将缺陷型λ噬菌体左向操纵子从att位点整合到大肠杆菌W31 10染色体上，建立了基于Red重组酶的高效修饰染色体DNA和BAC载体的新型同源重组系统。
Red系统介导的同源重组过程(图1)。λ噬菌体Red重组体系所包含的3个基因exo、bet和gain，彼此相邻的位于λ噬菌体Pl操纵子中。在噬菌体感染或原噬菌体诱导的早期表达。Exo蛋白作为5’-3’双链DNA依赖核酸外切酶结合于双链DNA上并以双链DNA末端为底物开始降解单链介导互补DNA链退火的单链结合，Bet蛋白紧密结合于35个以上核苷酸形成的单链DNA上，并保护DNA以免受单链核酸酶的攻击。Beta蛋白促进互补单链DNA之间的配对和退火：Gam蛋白不直接参与链交换，而是结合于RecBCD酶上形成RecBCD-Gam复合物，使RecBCD的核酸酶活性丧失，从而有利于线型双链DNA能在体内保留较长时间以完成重组。
2.2.2 Rac噬菌体编码的RecET重组系统。1998年Stewart等首先证明：大肠杆菌recBC sbcA菌株中的sbcA突变，激活整合在染色体上的Rac噬菌体重组酶基因recE和recT表达时，线性DNA可作为一种打靶分子经体内同源重组直接修饰BAC载体或大肠杆菌染色体，建立了ET克隆或RecET重组系统。
RecET重组系统将RecE、RecT重组基因置于大肠杆菌染色体上或构建到质粒上，重组过程不依赖于RecA，仅依赖RecE、RecT；所需的同源臂短，长度为30～50 bp就有很高的重组效率；重组效率高于RecA介导的重组。
从重组效率来看，源于Red系统的要稍高一些；而RecT和Redβ的组成型表达有利于提高重组效率。有些构建的E.coli菌株染色体上带有噬菌体的重组系统，如DY330N21，JC8679和Ym2000 等；也有些将这3个重组基因克隆在质粒上，如PBAD-ETg，PKD20和pBAD-αβγ等，带有这些质粒的细菌就具有重组的功能。
2.3 利用单链DNA进行的重组工程单链DNA(ssDNA)也可以作为打靶载体，而且构建更简单，重组效率比双链DNA的重组效率显著增高，有近6％的电转化细胞能发生重组。这些特点使之更便于修饰改造BAC。在大肠杆菌中，galK编码半乳糖激酶，代谢半乳糖。用单链寡核苷酸重
组，可将galK的一个碱基作了点突变，同时还移去了3.3kb的插人序列。ssDNA还成功地删除大肠杆菌染色体上5处不同位置的Tnl0插入。双链DNA的重组需Exo，Beta和Gam 3个蛋白，而单链DNA的重组仅需Beta 1个蛋白。核苷酸长70 bp时的重组效率最高，40～60 bp时效要降低至1／5。
白光兴等还发现，2条互补单链DNA的重组效率是不相同的，复制时的后随链DNA比先导链具重组优势，即与后随链退火的ssDNA重组效率高，这可能与复制方向及复制时2条链的合成机制不同有关。
3 重组工程的应用
在后基因组研究时代，利用重组技术可以实现对染色体的精确改造，如缺失、插入、突变、修复以及克隆等。
3.1 染色体上基因的修饰：敲入、敲除及替换近几年来已有许多研究者应用Red介导的重组工程技术对大肠杆菌染色体基因进行了改造，如敲入、敲除及替换等。PCR合成筛选标记基因两侧加上同源臂的线性打靶序列。同源臂序列靶向性精确地界定了染色体上拟敲除的DNA区域或基因敲入位点。可以在不删除任何染色体序列的情况下将外源基因准确插入染色体中(基因敲入)，敲除的染色体DNA长度可达到70 kb(基因敲除)
。
Yu等以长为70 bp的2条互补引物将gall(基因内第145位氨基酸的密码子TAT转变为TAG，产生了一个琥珀突变从而使重组子出现ga／K基因缺失的表型。在对λ噬菌体Red系统进行重组条件优化的研究中，Yu等以含抗性基因kan、amp、tet等的线性打靶序列替换大肠杆菌染色体上的ga／K，以cat替换编码RNasem的基因rnc的部分编码区序列，均获得了成功。他们的研究表明，线性打靶序列在标准电击转化条件下能获得0.1％的重组效率。
3.2 质粒DNA的靶向修饰基于λ噬菌体Red重组酶的重组工程同样可以应用于质粒DNA靶序列的基因敲除或敲入。质粒DNA可以是预先存在于受体菌内，也可以随线性打靶序列一同转化进受体菌。由于gam基因表达部分抑制了RecBCD酶活性，导致以ColE1为复制子的pBR322质粒在宿主中以滚环方式复制，结果将环状质粒单体转变成多聚体，多聚体形式的质粒不易发生体内同源重组，因此最好采用与线性打靶序列共转化的方式。另外，多聚体形式往往是重组质粒和母体质粒的混合物，为了获得纯的转化子，需要进行第2次转化。采用recA缺陷型的受体菌可以克服以上问题，成功地进行pBR322衍生质粒的靶向修饰。
3.3 空隙修复(Gap-Repair)方式获取目的基因——体内基因克隆应用重组工程技术可直接从存在于宿主体内的染色体、BAC或普通质粒上以Gap-Repair的方式获取目的基因。
依照s.cerevisiae重组工程的发展思路，现在正在开发通过Red重组进行直接克隆和亚克隆的策略(图2)。
在该过程中，线性靶分子是一个以质粒骨架为模板的PCR产物，它包括一个选择标记基因(sm)和一个复制起点(ori)。用于PCR的寡核苷酸引物应当包括同源区域(A和B)，这个同源区域能够明确地界定出所要克隆或亚克隆的DNA位置，这个选好的区域通过同源重组拷贝进质粒的骨架中。整个过程不需要限制酶、连接酶，可以从染色体、BAC或普通质粒的任何区域准确克隆目的基因，在体内将线性质粒载体的空隙修复。
4 展望
在功能基因组研究时代，重组工程技术开辟了一条具有广泛前景的道路。它简化了繁琐的体外重组操作，直接利用基因组的研究成果对染色体或染色体外基因组进行精确的操作，并且不受限制性内切酶酶切位点的影响。利用该项技术可以在大肠杆菌体内方便地进行DNA靶序列的敲除、敲人、克隆、突变等多种遗传工程操作。重组工程技术不仅有助于真核生物基因组功能研究，同时为原核生物特别是致病微生物的基因组改造、功能研究及疫苗开发等多个领域提供了新的研究手段。紧接着多种生物的基因组测序工作的结束，基因序列已经或即将公布，相信重组工程技术将极大地促进基因功能和微生物致病机理研究的迅速进展。