摘要：冻害是威胁油菜生产安全的重要因素之一，抗冻性影响油菜品种区域布局。目前对油菜的抗冻性遗传研究相对较少，抗冻性分子机理研究虽取得了一定进展，但与近缘模式生物拟南芥相比，研究还相对滞后。介绍了油菜抗冻性分子遗传的研究概况，并针对前人研究的部分结果阐述了一些观点。
关键词：油菜；抗冻性；分子遗传
中图分类号：Ｓ３３２．５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）03－0442-04
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Research Progress of Ｏｉｌｓｅｅｄ Ｒａｐｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ＦＡＮ Ｚｈｉ－ｘｉｏｎｇ１，２，ＬＥＩ Ｗｅｉ－ｘｉａ１，ＣＨＥＮ Ｆｅｎｇ－ｘｉａｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｈａｎ－ｚｈｏｎｇ２
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２． Ｏｉｌ Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： As freezing stress is a serous threat to oilseed rape production， freezing tolerance affects the regional distribution of oilseed rape cultivars. However， it is relatirely rare the genetic mechanism of freezing tolerance of rape. Though some progress has been achieve in the molecular study of freezing tolerane， it still lags behind that of the model organism Arabidopsis Thaliana. The research progress of molecular genetic mechanism of rape freezing tolerane was briefly introduced and some view were put out focusing on the results of previous studies.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ； ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
低温寒害是低温对热带或亚热带植物造成的伤害，包括零上低温（０～４℃）造成的冷害以及零下低温（冰点以下）造成的冻害。由于油菜是喜冷凉作物，经一段时间非冷冻型低温锻炼后，油菜遗传、形态和生理上都会发生变化，形成一定程度抗冻能力，这个过程称为冷驯化，它与抗冻性极显著相关。油菜抗冻特性的获得可能包含两种途径，一是经冷驯化或其他方法诱导（如脱落酸处理）而获得，另一种是不经处理，其基因型本身就具备一定的抗冻能力。前一种方式普遍存在于所有油菜资源中，但即使经驯化后，不同基因型耐受的最低温度仍然不同，如春性品种低温驯化后虽能耐一定程度冷害，但仍可遭受冻害。后一种方式一般存在于部分冬性或强冬性油菜资源中。
围绕油菜冻害形成和冷驯化的机制，国内外学者做了大量研究，包括冻害室内室外鉴定手段、冻害形成的生理生化原因、冷驯化的分子基础（如膜脂学、基因组学和蛋白组学）等。特别是借助模式生物拟南芥，植物抗冻性形成的分子机制已经取得了较大进展。
１油菜抗冻性鉴定方法研究进展
冻害遗传研究离不开抗冻性鉴定。田间冻害鉴定受气候因素和栽培方式等制约，偶然因素干扰较多，因此有必要发展室内模拟技术。早在１９７２年，Ｓｕｋｕｍａｒａｎ等［１］就发展出一套基于测定叶片电解质渗漏率来评价植株抗冻性的技术。后来，Ｒｉｓｔｉｃ等［２］在此基础上做了进一步修正，将电解质渗出率配以Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程，可以与半致死温度很好拟合。现在电解质渗漏率测定法已经成为包括ＰＮＡＳ、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ等ＳＣＩ期刊广为接受的一种方法。其原理为抗寒性越强，低温对细胞膜脂的伤害也越小，细胞电解质发生渗透的可能性也就越小，测定结果表现为电导率更小。
虽然仪器测量比较客观，鉴定的结果能反映控光控湿等可控条件下基因型的抗冻性，但室内鉴定往往无法评估基因型与环境的互作效应；而田间抗冻性是基因型与环境（包括气候干燥与否、栽培水平等）互作的结果，可以评价基因型与环境互作的效应，特别是经多年多点鉴定的以越冬率为指标的抗冻性在生产上更有其实践意义。但气候等因素年际间重复性差，因此，田间鉴定的数据误差也可能较大，实际遗传育种工作中可以先在室内初筛出抗冻基因型，再通过多年大田观察来进一步验证。
２油菜抗冻机理研究进展
早期关于植物冻害形成和抗冻机理的研究是从比较冻害敏感植物和抗冻植物或比较未经驯化的植物和冷驯化植物的实验设计入手，研究结果表明，抗冻力提高是与可溶性糖、膜磷脂、游离氨基酸特别是脯氨酸、脱落酸（ＡＢＡ）、脂肪酸的不饱和度增减有关，并指出维持膜系统功能结构的稳定性是维持和发展植物抗冻性的基础。但这些研究未能直接论证现象与抗冻性间的因果关系。之后的研究较长时间停留在膜保护系统、冷诱导特异蛋白（ＣＯＲＰ）的变化与植物抗冷力形成的关系。分子生物学特别是基因组学的迅猛发展，为彻底阐明抗冻机理提供了可能，尤其是借助模式生物拟南芥，植物冷驯化和抗冻性机理有了里程碑式进展。其抗冻性机理大致脉落为：细胞膜感知低温环境信号，通过信号转导激活以ＣＢＦ／ＤＲＥＢ为主的信号途径，兼与其他信号途径（如锌指蛋白ＺＡＴ１２、光周期等）交谈（Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）和交叠（Ｏｖｅｒｌａｐ），形成信号网络，继而调控下游相应功能蛋白的表达，赋予拟南芥低温抗性［３］。
拟南芥中对冷害和干旱的响应很大程度上是由转录因子调控的（图１）。这些调控过程有的依赖于ＡＢＡ，有的则与ＡＢＡ无关［４］。受低温诱导的
ＣＢＦ１～３基因（指ＣＢＦ１、ＣＢＦ２和ＣＢＦ３，下同）表达不依赖ＡＢＡ［５］，干旱诱导的ＣＢＦ４表达才依赖于ＡＢＡ［６］，无论在哪种情况下，转录因子ＣＢＦ（ＣＲＴ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ；又称ＤＲＥＢ１ｓ）都扮演中心角色，它们同属ＡＰ２转录因子家族。胁迫条件下ＣＢＦ１和ＣＢＦ３的表达虽先于ＣＢＦ２，但受ＣＢＦ２负调控，即一旦ＣＢＦ２开始表达，ＣＢＦ１和ＣＢＦ３就受到抑制［７］。正常情况下，拟南芥所有ＣＢＦ基因的表达水平都非常低；但在几分钟的低温胁迫（ＣＢＦ１~３）或干旱（ＣＢＦ４）后，它们的表达水平就能大大提高［８］。ＣＢＦ又受其他基因的调控，ＩＣＥ１是ＣＢＦ冷响应通道的上游转录调控因子之一，低温诱导下，通过与ＣＢＦ启动子中ＭＹＣ顺式作用元件的结合激活ＣＢＦ３基因表达［９］。而ＣＢＦ２启动子区存在两个片段，分别为ＩＣＥｒ１和ＩＣＥｒ２，有可能还存在其他ＩＣＥ类蛋白与这两个区域结合，协同调节冷胁迫下ＣＢＦ２基因的表达［１０］。ｈｏｓ１基因突变体中ＣＢＦ２、ＣＢＦ３及一些下游冷响应基因表达水平都能升高，因此，很可能ＨＯＳ１也是ＣＢＦ上游调控因子之一［１１］。
当然，除ＣＢＦ途径外，可能还存在与ＣＢＦ平行的冷响应调控方式，例如ＲＡＶ１［１２］和ＺＡＴ１２［１３］，它们的表达模式与ＣＢＦ１～３相似，但其表达水平在ＣＢＦ１～３过量表达情况下不受影响［１４］。
目前，拟南芥中对ＣＢＦ为中心环节的冷响应机制研究虽然比较清楚，但还有许多问题没有解决。追根溯源，对低温响应的机制是如何触发的，这种触发除涉及离子载体蛋白等结构基因外，还涉及哪些基因，处于ＣＢＦ上游的调节基因中，除ＩＣＥ１和ＨＯＳ１外，还有哪些基因调节ＣＢＦ的表达；往ＣＢＦ下游看，ＣＢＦ本身又调节哪些下游基因的表达，这些调控过程的信号是怎样转导的，除ＣＢＦ、ＲＡＶ１和 ＺＡＴ１２这３个“局域网”外，整个网络中应当还存在其他调控方式，例如，光周期也可能涉及低温响应，短日照会增强拟南芥抗性［１５］；网络中的每个基因对拟南芥生态群不同基因型表型变异能解释多少遗传效应。另外，当前大量研究都集中于冷驯化和冻害过程，对冻后植株恢复包括膜脂类修复则很少关注，而新的研究结果证明，这种冻后修复机制对植株特别是作物同样重要［１６］。
３油菜抗冻性遗传研究进展
大多数作物的抗冻性遗传非常复杂。不同作物遗传方式不同，甚至同一作物研究结果也不一致，如冬小麦抗冻性受隐性或部分显性基因控制，苜蓿抗冻性存在显著的加性效应或不完全显性效应，而马铃薯的抗冻性则可能受不完全隐性基因控制。
目前有关甘蓝型油菜的抗冻性遗传研究的报道较少。Ｔｅｕｔｏｎｉｃｏ等［１７］对白菜型油菜和甘蓝型油菜进行了抗冻性基因定位，结果在白菜型油菜分离群体中检测到４个ＱＴＬ，而甘蓝型油菜中则未检测到ＱＴＬ。Ｋｏｌｅ等［１８］定位了油菜抗冻性，共检测到１６个ＱＴＬ，其中６个ＱＴＬ在多个冬天均能检测到，且田间越冬率和室内冷驯化条件下鉴定抗冻性ＱＴＬ存在重叠或连锁。Ａｓｇｈａｒｉ等［１９］用ＣＩＭ（复合区间）作图法对甘蓝型油菜抗冻性进行了定位，结果只检测到一个仅能解释５．０％变异的ＱＴＬ。之后，该研究小组又往图谱中增加了３２个ＳＳＲ标记，这次检测到多达１２个ＱＴＬ，这些ＱＴＬ解释的表型变异从０．５％至１１．０％不等［２０］。当他们以ＬＤ５０（５０％植株致死温度）为指标，采用不同作图方法对抗冻性进行ＱＴＬ检测时，则检测到４个ＱＴＬ，共解释２４．０％的ＬＤ５０表型变异，且越冬率和ＬＤ５０间存在相关［２１］。一方面这些研究表明室内鉴定可以作为抗冻性指标，但另一方面却反映了ＱＴＬ作图的局限性，其效果受群体、作图方法、图谱标记密度等因素影响。
４油菜抗冻性研究的方向与展望
上述研究中的ＱＴＬ区间均未能直接证明存在与ＣＢＦ类冷胁迫响应相关的候选基因。Ｌｅｏｎｉｄ等则巧妙采用了转基因方法，筛选到大量包括ＣＢＦ响应途径在内的大量ＥＳＴ序列。他们将２个ＣＢＦ／ＤＲＥＢ１转录因子（ＢＮＣＢＦ５和ＢＮＣＢＦ１７）分别接上３５Ｓ启动子导入春性品种Ｗｅｓｔａｒ，让ＣＢＦ调节的基因组成型表达，构建转基因单株四叶期叶片ｃＤＮＡ文库用于ＥＳＴ测序［２２］。除与野生型单株中基因表达量近似的“看家基因”外，这些转基因单株中筛选到的ＥＳＴ还涉及ＣＯＲ（冷调节基因，被导入的ＣＢＦ因子激活）、光合作用和叶绿体发育相关的基因。因此，该研究从转录水平上提供了大量可供继续研究的候选基因。但他们未研究转录后及蛋白水平上基因的调控行为（如蛋白激酶和蛋白质磷酸化酶就对ＢＮ１１５基因在翻译水平上存在调控）。而且，既然油菜资源（包括春性、冬性、强冬性）中都含有这些基因，为什么不同油菜种质资源间抗冻性存在巨大的差异；另外，该研究还发现在冷驯化条件下，转基因和野生型植株的抗氧化产物和氧清除酶基因表达都增加了。这说明，除看家基因与抗冻性无关外，表达发生变化的基因也不一定都与抗冻性有关。该研究提供的只是候选基因而已，与资源抗冻性差异真正有关的基因中，哪些又是主效基因，是否这些主效基因的调控区和（或）结构部分变异引起抗冻性的差异。此外，有研究表明，即使转录因子在扮演中心角色，也不意味着所有这些转录因子都适合转基因抗性育种，例如，转基因过量表达ＤＲＥＢ２只引起其下游基因表达量较弱的增加，最终不会产生更强的抗胁迫能力［２３］；而当组成型过量表达ＣＢＦ１～３，确实增强了转基因油菜抗冻性和光合作用（植株受冻后光合作用能力提高，增加更多的碳源，以便渡过逆境），但同时也伴随生长延滞、开花延迟、产量严重下降等不利农艺性状［２４］。而按通常思维既然转
ＣＢＦ可以提高植株的光合作用效率和能力，转基因植株产量应当更高才是。所有这些问题，都值得深入研究。对植物胁迫响应机制研究的主要目标之一在于服务转基因抗逆育种，所以，也只有完整了解到植物对胁迫（包括低温）的响应机制（修复机制），才能更好地应用遗传工程手段改进作物的抗性。
要完整了解油菜抗冻性的遗传还有很长的路要走，虽然Ｌｅｏｎｉｄ等［２２］的研究成果还存在缺憾，但毕竟提供了大量候选基因，无疑会加快育种进程，特别是分子标记辅助育种进程。
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［２１］ ＡＳＧＨＡＲＩ Ｌ Ａ， ＭＯＨＡＭＭＡＤＩ Ｓ Ａ， ＭＯＧＨＡＤＤＡＭ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｒａｐｅｓｅｅｄ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｅｑ， ２００８，２２（１）：５４８－５５２．
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［２３］ ＬＩＵ Ｑ， ＫＡＳＵＧＡ Ｍ， ＳＡＫＵＭＡ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ， ＤＲＥＢ１ ａｎｄ ＤＲＥＢ２， ｗｉｔｈ ａｎ ＥＲＥＢＰ／ＡＰ２ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｗｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｄｒｏｕｇｈｔ－ ａｎｄ ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９８， １０： １３９１－１４０６．
［２４］ ＪＡＧＬＯ Ｋ Ｒ， ＫＬＥＦＦ Ｓ， ＡＭＵＮＤＳＥＮ Ｋ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃ－ｒｅｐｅａｔ／ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｌｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ａｒｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００１，１２７（３）：９１０－９１７．