对照（CK）。浓度水平设置如表2所示。
1.2 测定指标与方法
采用硫代巴比妥酸法[16]測定丙二醛（MDA）含量，参照植物生理学试验技术的方法[17]测定过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）以及脯氨酸的含量。可溶性蛋白质的含量采用考马斯亮蓝G-250的方法测定[17]。以上指标均于2015年6月测定。
1.3 数据处理
每个浓度梯度下的植物随机抽取3份进行指标测定，数据以平均值表示。采用Excel 2003软件进行数据整理，并采用Origin 8.5进行制图。
2 结果与分析
2.1 不同重金属胁迫对日本楤木丙二醛含量的影响
丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化的主要产物之一，其含量变化可作为检测逆境条件下植物受伤害程度的指标之一[18]。从图1可以看出，在重金属Pb的胁迫下，日本楤木中MDA的含量呈下降趋势，在T2处理水平时达到最低，为对照组的86%，其后MDA的含量随着重金属浓度的增加而急剧上升，在T4处理组时达到最高，为对照组的127%。在重金属Cd的胁迫下，日本楤木中MDA的含量也呈先降后升的趋势，但是与Pb处理组不同的是，MDA的含量在T1的时候达到最低，为对照组的85%，随着浓度的增加，MDA在植物体内逐渐积累，并在T4时到达最高，为对照组的121%，其含量低于Pb处理组的含量。从图1中还可发现，除了在T2处理组时，Cd胁迫下日本楤木体内的MDA含量高于Pb胁迫下外，其余均是Pb胁迫下的MDA含量高于Cd胁迫下，这可能是Pb比Cd更能促进日本楤木体内MDA含量的积累，表明Pb可能对细胞产生毒害作用更大。
2.2 不同重金属胁迫对日本楤木脯氨酸含量的影响
脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，其积累量可表征植物对逆境适应的能力，所以植物叶片中脯氨酸含量往往被认为是测定逆境胁迫的重要指标[19]。由图2可知，在重金属Pb胁迫下，脯氨酸的含量略有下降，但减少程度仅为对照组的1%。其后，随着重金属浓度的增加，脯氨酸含量急剧上升，但在T2、T3浓度时，上升速度减慢，随后又急剧上升。在重金属Cd胁迫下，在浓度为0.25 mg/kg时，脯氨酸含量达到最低值，为对照组的84%。随着浓度梯度的升高，脯氨酸的含量也相应地急剧上升，在浓度达到5 mg/kg时，脯氨酸的含量增加幅度不大，仅为2%。从图2中还可发现，Pb胁迫下的脯氨酸含量比Cd胁迫下的要高，在T3处理水平时，Pb、Cd胁迫下的日本楤木体内的脯氨酸含量相近，相差仅为4%。植物体内脯氨酸含量增加的原因可能是重金属刺激了脯氨酸的合成，也可能是重金属的胁迫抑制了脯氨酸的氧化，或是阻碍了植物体内蛋白质的合成。
2.3 不同重金属胁迫对日本楤木抗氧化酶活性的影响
在正常情况下，细胞内的活性氧自由基的产生和清除则处于一种动态平衡状态。当植物受到胁迫时，这个平衡就被破坏，从而导致大量的活性氧自由基在体内积累，对细胞造成损害[20]。然而植物细胞自身配有一个抗氧化防御系统来抵抗伤害，其中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）都是含血红素Fe的蛋白质，都能分解H2O2，在植物抗逆性、氧伤害以及器官的衰老中发挥着重要的作用。
2.3.1 不同重金属胁迫对日本楤木过氧化物酶活性的影响 过氧化物酶（POD）是一种广泛分布于植物体组织中的一种抗逆适应性酶，它可以反映出植物生长发育、体内代谢以及对外界环境的适应性[20]。由图3可知，无论是在Pb胁迫下还是在Cd胁迫下，日本楤木叶片内的POD活性均随着重金属浓度的增加呈下降趋势，这与杨盛昌等[21]的研究结果不一致。在重金属Pb、Cd的浓度分别达到最高浓度1 500和10 mg/kg时，日本楤木叶片内的POD含量都达到最低，分别为对照组的72%和46%，因此可以发现Pb对日本楤木体内的POD活性影响更小，对于同种浓度水平，可以推测日本楤木对重金属Pb的抗胁迫能力较强。在Pb胁迫下，当土壤中Pb浓度达到1 000 mg/kg时，日本楤木体内的POD活性基本不变，仅下降了3%，可以推测出当Pb胁迫浓度达到 1 000 mg/kg时，POD的活性达到了一个阈值，日本楤木的抗重金属Pb的胁迫能力达到最大。
2.3.2 不同重金属胁迫对日本楤木过氧化氢酶活性的影响 过氧化氢酶（CAT）是植物体内的一种重要的氧化还原酶，可以清除在逆境胁迫下产生的H2O2，避免了H2O2对植物组织的伤害，从而还抑制了由Haber-Weiss反应而产生的毒性更强的·OH，维持了活性氧的代谢平衡，保护了细胞膜的完整性[22]。由图4可知，在重金属Pb胁迫下，随着Pb浓度的增加，日本楤木体内的CAT活性呈先增后减的趋势，在Pb浓度为1 000 mg/kg时，CAT活性达到最高，与对照组相比活性增加了21%，这与龚双姣等[23]研究Cd对3种藓类抗氧化酶活性的影响得出的结论类似，可以推断出在受重金属迫害较轻时，体内活性氧逐渐增多，促进了抗氧化酶活性的升高；在受重金属迫害较重时，超过了植物自身防御反应的极限，导致植物的结构受到破坏，从而使酶的活性降低。而在重金属Cd胁迫下，随着Cd浓度的增加，日本楤木体内的CAT活性急剧上升，在浓度为10 mg/kg时，与对照组相比活性增加了70%，这与孙守琴等[24]的研究结果相反，可能说明Cd有助于促进日本楤木CAT活性的增加。在T1处理组时，Pb胁迫下的CAT活性与Cd胁迫下的CAT活性较相近，可能在较低浓度时，重金属Pb或Cd对日本楤木的CAT活性影响相近，清除活性氧的能力基本一致。
2.4 不同重金属胁迫对日本楤木叶绿素含量的影响
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其含量高低是植物光合作用效率高低的一个重要指标[25]。由图5可知，在重金属Pb胁迫下，叶绿素的含量有明显的提高，随着Pb浓度的增加，叶绿素的含量呈明显的下降趋势。在Pb浓度为100 mg/kg时，叶绿素的含量达到最高，为空白对照组的114%；在浓度为1 500 mg/kg时，日本楤木体内叶绿素的含量达到1.7 mg/g，与对照组相比降低了21%。在重金属Cd胁迫下，随着Cd浓度的增加，日本楤木体内的叶绿素含量呈先减后增再减的趋势，在Cd浓度达到 1 mg/kg时，植物体内叶绿素的含量达到最低，为1.68 mg/g，在浓度为5 mg/kg时，叶绿素的含量有所增加，但其含量仍低于对照组5%。从图5还可以发现，在T2处理水平之前，Pb胁迫下日本楤木体内叶绿素的含量明显高于Cd胁迫下的含量，但在T3处理水平之后，Cd胁迫下的叶绿素含量要高于Pb胁迫下的含量。有研究表明，重金属胁迫容易导致植物的光合作用受到抑制，叶绿素含量越低，说明植物受胁迫程度越大；反而叶绿素含量越高，植物受胁迫程度越小[26]。因此可以推測在土壤中重金属浓度较高时，Pb对日本楤木的胁迫程度要比Cd对植物的胁迫程度大，而在较低浓度时则相反。
2.5 不同重金属胁迫对日本楤木可溶性蛋白质含量的影响
蛋白质是衡量植物代谢和生理状态的一项重要指标。由图6可知，在重金属Pb胁迫下，随着Pb浓度的增加，植物体内可溶性蛋白质的含量呈先增后减的趋势。在浓度为100 mg/kg时，蛋白质的含量达到最大值，为对照组的107%，随着Pb浓度的增加，蛋白质的含量呈下降趋势，但在浓度为1 000 mg/kg后的下降程度不大。在重金属Cd胁迫下，日本楤木体内的可溶性蛋白质含量也呈先增后减的趋势，这与孙天国等[25]研究的结果相同，表明重金属Cd可以引起可溶性蛋白质含量的增加，这可能是植物为了抵抗重金属Cd对自身的伤害而诱导产生了Cd络合蛋白，从而降低Cd的毒害。可溶性蛋白质含量的增加，有助于维持细胞的正常代谢，增强植物的抗逆性。当土壤中Cd浓度为0.25 mg/kg时，日本楤木内的可溶性蛋白质含量达到最高，为对照组的105%。从图6还可以发现，在T1浓度梯度下，无论是Pb还是Cd胁迫下，日本楤木体内的可溶性蛋白质的含量都有所提高，且Pb胁迫下的比Cd胁迫下的可溶性蛋白质含量要高，可能是低浓度的重金属Pb较Cd更能促进蛋白质含量的增加，间接地使细胞渗透势和功能蛋白的数量得到增加，有利于维持细胞正常代谢，从而提高了日本楤木的抗逆性。
3 小结与讨论
植物在正常生长条件下，活性氧的产生和清除处于一种平衡状态，当处于逆境胁迫时，植物体内活性氧的产生和清除的稳态则会受到破坏，往往会发生膜脂过氧化作用，使植物生长受到了伤害[20]。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用的最终产物，其含量可以作为膜脂过氧化强弱和质膜破坏程度的重要指标。张凤琴等[22]指出重金属容易导致膜脂过氧化，并且重金属离子的浓度越高，MDA在植物体内就会积累越多。本试验结果表明，在重金属Pb、Cd单一胁迫下，植物叶片内MDA的含量减少，并分别在500、0.25 mg/kg时达到最低，这可能是因为较低浓度的重金属可促进日本楤木体内不饱和脂肪酸的合成，或是因为低浓度的重金属对植物体内活性氧自由基的清除能力被诱导加强，导致MDA含量降低。同时也说明不同重金属对同一植物的过氧化作用表现不同。其后，随着重金属浓度的增加，植物体内的MDA含量相应地增加。
在重金属的胁迫下，细胞膜中的不饱和脂肪酸发生了过氧化反应，从而导致细胞膜的组成和其完整性遭到破坏，细胞的内容物大量外渗，有毒物质自由进出细胞，从而导致植物体内一系列生理生化反应失调。在本试验中，在重金属Pb、Cd胁迫下，植物体内的脯氨酸含量均呈先降后升的趋势。在起初，脯氨酸含量降低可能是因为在植物刚受到胁迫时的一种不适应的表现，其后植物体内脯氨酸含量的增加是植物体对逆境胁迫的一种正常的生理生化反应，其含量增加可能说明细胞的结构和功能遭受到伤害，也可能是植物在逆境胁迫下的一种适应性表现。
在重金属胁迫下，植物体内产生大量的活性氧自由基，破坏了活性氧的代谢平衡，引起蛋白质等大分子的变性，导致膜脂过氧化从而使植物受到伤害。而植物体内的POD、CAT等抗氧化系统通过自身的抗氧化作用来提高对重金属的抗性，从而保护植物免受伤害[15]。本研究结果显示，在重金属Pb的胁迫下，日本楤木体内的POD活性随着Pb浓度的增加而逐渐降低，而CAT的活性则是随着Pb浓度的增加呈先增后减的趋势，可能是因为CAT是一个含有Fe3+的金属酶，重金属离子会取代分子中的Fe3+而使其活性降低，也有可能是因为活性氧自由基的积累导致分子的空间结构发生改变，从而导致CAT活性降低。在重金属Cd胁迫下，日本楤木体内的POD活性随着Cd浓度的增加呈直线下降的趋势，而CAT活性则随着Cd浓度的增加呈直线上升的趋势，由此可以推断出在Cd浓度较低时，日本楤木体内发挥着抗氧化能力的酶主要是POD，在Cd浓度较高时，日本楤木体内的CAT发挥着主要的抗胁迫作用。
当植物生存环境发生变化时，叶绿素的变化在一定程度上可以反映出外界环境因素对植物产生的影响。叶绿素含量的降低是衡量叶片衰老的一个重要指标[25]。受重金属Pb胁迫下的日本楤木体内叶绿素的含量随着Pb浓度的增加呈先增后减的趋势，与宋勤飞等[27]研究Pb胁迫对番茄生长的影响一致。也有研究表明，随着重金属浓度的增加，叶绿素的含量降低，说明植物的光合作用系统受到了不可修复的破坏，使细胞膜和叶绿体的结构发生改变，从而导致叶绿素的含量下降[26]。这与本试验研究的在重金属Cd胁迫下，日本楤木体内的叶绿素含量随着Cd浓度的增加而降低基本一致。本试验中，在Cd浓度为20 mg/kg时，日本楤木体内的叶绿素含量有所上升，具体原因还有待分析。但就总体而言，可以说明受重金属胁迫的植物，叶绿体的合成会受到影响，叶绿素的含量则会相应减少，间接地对植物的光合作用也会产生不利影响，从而加速植物的老化。
可溶性蛋白质大多数是与膜系统特异结合的酶，其含量越高说明其代谢活动越旺盛，越有利于植物抵抗不良环境的胁迫和伤害[28]。重金属可能诱导大量的防御物质形成，然而这些物质往往是蛋白质，这样可以使细胞的渗透势和功能蛋白的数量得到增加来维持细胞的正常代谢[29]。然而这种蛋白质含量的增加是有限度的，随着重金属浓度的进一步增加，加快了可溶性蛋白质的分解，使得合成系统遭到破坏，导致可溶性蛋白质含量下降。本试验结果也验证了这一说法。在Pb、Cd浓度分别为100、0.25 mg/kg时可溶性蛋白质的含量均有所上升，其后可溶性蛋白质的含量都急剧下降，说明植物体内的抗逆性在逐渐减弱，细胞代谢受到阻碍。
综上所述，不同的重金属对同一木本植物的伤害是多方面的，对植物的生理生化指标的影响也不尽相同，而具体响应机制还有待深入研究，同时还可针对其他重金属对日本楤木的影响进行研究分析。
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