对照几乎无明显差异。[结论] 核桃青皮乙酸乙酯提取物对烟草病毒具有良好的防治效果。
Abstract： [Objective] To explore the different solvent extracts from walnut green husk on tobacco virus growth inhibitory effect. [Methods] Taking Shangluo local production of walnut green husk as raw material， using ethyl ether， chloroform， ethanol， ethyl acetate and acetone five solvent extracts were prepared by refluxing method. The extract was prepared by reflux extraction method， and then the growth inhibition effect of different solvent extracts on tobacco mosaic virus and cucumber mosaic virus was determined by half leaf method. [Results] In the test conditions of different solvent extracts from walnut green husk on tobacco mosaic virus and tobacco cucumber mosaic virus has certain inhibitory effect， and with the increasing concentration of the extracts showed a good dose-response relationship. The ethyl acetate extract effect best， the highest inhibition rate could reach 65.9%， 52.3%， almost no the obvious difference with the positive control of the same concentration. [Conclusion] The ethyl acetate extract of walnut green husk has good control effect on tobacco virus.
关键词： 核桃青皮；提取物；烟草花叶病毒；烟草黄瓜花叶病毒；生长抑制
Key words： walnut green husk；extract；tobacco mosaic virus；cucumber mosaic virus；growth inhibition
中图分类号：S314 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2016）34-0209-03
0 引言
核桃青皮，药材名为青龙衣（Juglae regia L.）是胡桃科胡桃属植物胡桃楸和核桃未成熟果实的外果皮[1]。核桃与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”，是深受民众喜爱的坚果类食品之一，被誉为“万岁子”、“长寿果”。核桃青皮始载于《开宝本草》，称之为胡桃青龙，《救急方》中称之为青胡桃皮，自《山东中草药手册》称之为“青龙衣”后，现多延用此名称[2]。
我国核桃栽植历史悠久，核桃资源十分丰富，在陕西商洛核桃久负盛名，以商洛地区的商州区、洛南、商南、山阳、柞水等区县产量最多，全市共有核桃2000多万株，是新中国成立前夕的13倍。年产量达1000多万公斤，是我国产核桃较多的地方，品种也最多，素有“核桃之乡”的美誉[3]。核桃果实一般在秋季采收后脱掉的核桃青皮堆放在田间、地头或河沟边，既浪费原材料，又污染环境。如果能从这些废弃物中找出具有抑制烟草病毒的活性成分，那将具有重大意义，这不仅能在一定程度上缓解大量核桃青皮堆积带来的环境问题，还能增加果农收入，真正实现“变废为宝”[4]。本文以烟草花叶病毒（TMV）和烟草黄瓜花叶病毒（CMV）为供试病毒，采用不同溶剂对核桃青皮进行提取，测定其对烟草病毒的生长抑制情况，以期为商洛核桃青皮的回收利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
①普通烟叶，源于洛南县永丰冀洼村烟叶试验基地植株，为烟草病毒的系统侵染寄主烟叶，主要用于病毒的繁殖、保存和后续实验研究。
②心叶烟为烟草花叶病毒和烟草黄瓜花叶病毒的局部枯斑寄主，实验所用烟苗首先采用水培育苗技术进行培育，适时移栽至直径25cm的花盆中进行土培，待生长一定时间后，挑选长势匀称7-8叶期的幼苗用于后续的病毒接种试验。
③核桃青皮：2015年8-9月份采自陕西洛南县核桃产区，自然风干，研磨粉碎，过60目筛，然后密封于玻璃容器内，置4℃冰箱中冷藏，备用。
1.2 试验方法
1.2.1 核桃青皮不同溶剂提取物的制备
精密称取青龙衣粉末样品60g，置于1000mL圆底烧瓶中，分别加入600mL的乙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等提取溶剂进行回流提取3h，过滤后减压浓缩，干燥即得不同溶剂提取物。
1.2.2 供试病毒的制备
选取TMV、CMV普通株系，保存在普通烟株上，接种前取发病的鲜叶，剪取新鲜的带病毒的烟叶，称取5g新鲜叶片，去叶柄，并撕成碎片，静置，过滤，定容至100mL的烧杯中贮藏备用，即得病毒原液。
1.2.3 样品溶液制备
①待测样品溶液制备：将核桃青皮的乙醚、氯仿、乙醇、乙酸乙酯、丙酮的5种提取物用5%的二甲基亚砜（DMSO）溶液分别配制成1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL的溶液备用。在制备的样品溶液中分别加入烟草花叶病毒和烟草黄瓜花叶病毒的供试病毒提取液各1mL，混匀，备用。
②对照品接种液的制备：精确量取烟草花叶病毒和烟草黄瓜花叶病毒各1mL，同时加入5%的二甲基亚砜（DMSO），再加入市面上销售的农药作为阳性对照。
1.2.4 烟草病毒接种
采用半叶法摩擦式进行接种，待烟苗长至6-8片真叶时，精心挑选健康、长势旺盛、叶片大小匀称的心叶烟株苗。以叶脉为界，左半叶接种含有普通烟草花叶病毒（TMV）或烟草黄瓜花叶病毒（CMV）的供试药剂接种液，右半叶接种对照溶液。接种时用吸管吸取一定量的接种液，在每个待接种叶片的叶面上滴数滴，然后用食指向同一方向轻轻磨擦3-5次，面积约2-3cm2，最后用清水冲洗接种叶片表面[5]。每处理接种10-15个叶片，重复5次，72h后分别统计枯斑数目，抑制率计算公式为：
抑制率（%）=（对照平均每叶枯斑数-处理每叶枯斑数）/对照平均每叶枯斑数×100%
2 结果与分析
2.1 不同溶剂提取物对TMV的生长抑制作用
从表1中可以看出，核桃青皮不同溶剂提取物对烟草花叶病毒的生长抑制作用有明显差异，伴随着质量浓度的不断增加抑制率亦在逐步增大，表明二者之间呈现较好的量效关系。由表中可见，阳性对照的抑制率最高，其次为乙酸乙酯提取物和氯仿提取物，乙醇提取物次之，最后是乙醚和丙酮提取物。其中，乙酸乙酯提取物对烟草TMV病毒的生长抑制率非常接近同浓度的阳性对照，且无明显差异。
从表1中可以看出，除阳性对照之外，对烟草花叶病毒生长抑制作用最强的是核桃青皮的乙酸乙酯（提取物Ⅳ）提取物，当浓度为20mg/mL时，抑制率为65.9%，非常接近同浓度的阳性对照药物69.8%，而在此条件下氯仿提取物的抑制率也达到了58.5%。这说明核桃青皮乙酸乙酯和氯仿提取物具有进一步开发成抗烟草花叶病毒制剂的潜力。同时，随着质量浓度从1mg/mL增加到20mg/mL，各提取物对烟草TMV病毒的生长抑制作用均在不断增加，有些增加幅度大，有的增加幅度小，这可能与不同溶剂提取物提取的活性成分不同而有所差异。
2.2 不同溶剂提取物对CMV的生长抑制作用
从表2中可以发现，核桃青皮不同溶剂提取物对烟草黄瓜花叶病毒的生长抑制作用有较大差异，伴随着质量浓度的不断增加抑制率亦在逐步增大，表明二者之间呈现较好的量效关系。由表中可以看出，阳性对照的抑制率最高，其次为乙酸乙酯提取物，氯仿提取物次之，最后是乙醚、乙醇和丙酮提取物。其中，乙酸乙酯提取物对烟草CMV病毒的生长抑制率比较接近同浓度的阳性对照。
从表2中可以看出，除阳性对照之外，对烟草黄瓜花叶病毒生长抑制作用最强的是核桃青皮的乙酸乙酯提取物，当浓度为20mg/mL时，抑制率为52.3%，比较接近同浓度的阳性对照药物69.8%。这说明核桃青皮乙酸乙酯具有进一步开发成抗烟草黄瓜花叶病毒制剂的潜力。总体来说，核桃青皮不同溶剂提取物对烟草黄瓜花叶病毒的生长抑制作用要弱于烟草花叶病毒。
综上所述，核桃青皮不同溶剂提取物对TMV和CMV的生长抑制作用不尽相同。其中核桃青皮乙酸乙酯提取物对烟草病毒的生长抑制作用最好，最接近阳性对照药物，随着其浓度的增大，其对病毒的抑制率亦在增加，相比其他几种溶剂的核桃青皮提取物，效果要好得多。
3 结论与讨论
研究结果表明，核桃青皮不同溶剂提取物对烟草花叶病毒和烟草黄瓜花叶病毒均有一定的生长抑制作用。在五种不同溶剂提取物中，以乙酸乙酯提取物和氯仿提取物对烟草病毒抑制作用最好，最接近阳性对照，其次为乙醇提取物，最后是乙醚和丙酮提取物。
核桃青皮在不同的溶剂中溶解度不同，所以在制备提取物的过程当中，选择提取溶剂非常重要[6]。本文分别用5种常见的不同极性溶剂提取核桃青皮中的活性物质，研究其不同溶剂提取物对烟草花叶病毒和烟草黄瓜花叶病毒的生长抑制作用，从而选择最佳的提取溶剂。在研究过程中发现，乙醚、氯仿和丙酮等有机溶剂的提取率相对较低，所能提出的活性物质较少，以至于制约后续实验的开展。对于像乙醚等这一类亲脂性易挥发有机溶剂，在提取的过程很容易受环境因素影响，必须严格控制实验过程中的非条件因素，这一点在岑建斌的研究中得到了证实[7]。与此同时，翟梅枝等[8]研究亦表明核桃青皮低极性组分具有抗TMV活性，结合本研究，这说明核桃青皮提取物具有开发成新型植物源农药的潜力。
参考文献：
[1]周媛媛，王栋.青龙衣化学成分的研究[J].中医药信息， 2010，27（2）：18-20.
[2]张建斌.甘肃青龙衣（核桃青皮）化学成分的研究[D].兰州： 西北师范大学，2009.
[3]张卫星，何开泽，蒲蔷.核桃青皮提取物的抗菌和抗氧化活性[J].应用与环境生物学报，2014，20（1）：87-92.
[4]皮新梅.青龙衣化学成分及杀虫活性的研究[D].北京：北京化工大学，2014.
[5]郭琪.核桃叶青皮中黄酮类化合物的初步分离及其活性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2008.
[6]李海洋.核桃青皮有效化学成分及抑菌性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.
[7]岑建斌，区硕俊，李秀英，等.丹参药材中丹参酮ⅡA的提取工艺优化及研究分析[J].当代化工，2016，45（8）：1753-1755.
[8]翟梅枝，黄海玲，李鹏影，等.核桃青皮中低极性组分抗TMV作用机制研究[J].西北农业学报，2009，18（4）：170-172.