材料与方法
1.1供试材料
华北大黑金龟鳃幼虫:取冬眠期幼虫。
1.2培养基
TNYE培养基:酵母膏 0.25 g,K2HPO4 0.5 g,琼脂 15.0 g,pH值为7.2,NaCl 10%,水1 L,pH值7.2。
淀粉-酪素培养基:葡萄糖5 g,可溶性淀粉5 g,蛋白胨2 g,酵母膏1 g,CaCO3 2 g,琼脂15 g,pH 值 7.2,NaCl 10%,水1 L,pH值7.2。
甘油天门冬氨酸培养基:甘油10 g,L-天冬氨酸1 g,K2HPO4 1 g,MgSO4 0.1 g,琼脂15 g,pH值 7.2,NaCl 10%,水1 L,pH值 7.2。
羧甲基纤维素钠培养基:羧甲基纤维素钠20.0 g,磷酸氢二钠2.5 g,磷酸二氢钾1.5 g,蛋白胨2.5 g,酵母膏0.5 g,琼脂15.0 g,水1 L,pH值7.2。
ISP2培养基:酵母提取物4 g,麦芽提取物10 g,葡萄糖 4 g,水1 L,琼脂15 g,pH值7.2。
LB培养基:胰化蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,琼脂15 g,pH值7.0。
PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,20 g琼脂,1 L水。
基础盐培养基:
NaCl 1.00 g,NH4NO3 1.00 g,K2HPO4 1.50 g,KH2PO4 0.50 g,MgSO4·7H2O 0.10 g,水1 L,pH值7.0。
1.3金龟幼虫肠道微生物的分离
清洗5支试管,每支试管注入10 mL蒸馏水,加上试管塞,用高温灭菌锅121 ℃灭菌20 min,取出后使其冷却至室温,并标上编号为1、2、3、4、5。打开无菌操作台进行紫外灭菌。选取冬眠的金龟幼虫放入75%的乙醇中浸泡2 min,在无菌操作台上取出虫体放在培养皿中无菌解剖。取少量肠道里白色物质,放入标号为1的试管,然后盖上试管塞摇晃使微生物分布均匀,取出后在无菌操作台上进行梯度稀释。从稀释103倍和104倍的菌液中取50 μL,分别滴入供分离用的培养基中(分离培养基:TNYE培养基,淀粉-酪素培养基,甘油天门冬氨酸培养基,羧甲基纤维素钠培养基),涂布均匀,把培养皿倒置放入恒温保温箱内30 ℃培养8 d。观察菌落生长情况,统计菌落数,并挑取部分菌株转接于试管中保存。
1.4部分分离菌株的初步鉴定
通过测定16S rRNA 基因序列进行初步鉴定,分离菌株总DNA 的提取参照文献[11]的方法进行,PCR 扩增采用细菌16S rRNA 通用引物(27F:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′;1492R:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR 反应条件为:94 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,共35 个循环,72 ℃ 10 min。PCR 产物用经EB 染色的0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后测序。依照测序结果,从NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库中调出相似性较高相关菌株的16S rRNA基因序列,进行序列比对分析。
1.5降解辛硫磷和毒死蜱菌株的筛选
配制含辛硫磷和毒死蜱有效成分100 mg/L基础盐培养基,将分离获得的菌株接种于培养基上,置于28 ℃ 恒温培养箱中培养,生长状况良好(能形成菌落)的即定为可降解菌。
2结果与分析
2.1各培养基菌株分离情况
由表1可知,选用的4种培养基培养微生物,淀粉-酪素培养基获得的微生物数量最多,0.5 g湿样/mL在稀释103倍下平板菌落数162个,稀释104倍下获得菌落数36个,羧甲基纤维素钠培养基次之,甘油天门冬氨酸培养基最差,在稀释103倍下平板菌落数为30个。
2.2分离获得的菌株种类情况
从各种培养基中共挑取菌株65株,细菌保存于含LB培养基斜面试管中,放线菌保存于含ISP2培养基斜面试管中,从65株菌株挑取了13株有代表性的菌株进行测序分析,由比对结果(表2)可知,幼虫肠道微生物至少包括原小单孢菌属(Promicromonospora)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、冢村氏菌属(Tsukamurella)、壤霉菌属(Agromyces)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、詹森菌属(Janthinobacterium)、小单孢菌属(Micromonospora)、链霉菌属(Streptomyces)等9个属。
2.3肠道微生物对2种农药的降解情况
挑选部分获得的菌株,进行降解毒死蜱和辛硫磷的试验,结果见表3。
供试的28株菌株中,在以毒死蜱(浓度100 mg/L)为唯一碳源的基础盐培养基中,能形成菌落的菌株为8株,占供试菌株28%,在以辛硫磷为唯一碳源的基础盐培养基中,能形成菌落的菌株为19株,占供试菌株67.8%,对毒死蜱和辛硫磷都能降解的有CH1、CH19、CH32、CH33、CH44、CH47(Sac
3讨论
华北大黑鳃金龟幼虫肠道微生物的分离试验选用的4种培养基中,淀粉-酪素培养基分离效果最好,甘油天门冬氨酸培养基分离效果最差。因此,在做肠道微生物分离试验时建议使用淀粉-酪素培养基。
通过研究表明,一些肠道微生物对农药有降解作用,本试验中,华北大黑鳃金龟幼虫肠道微生物对辛硫磷降解作用优于毒死蜱,说明在防治华北大黑鳃金龟时,毒死蜱防治效果可能优于辛硫磷,肠道微生物的降解作用可能是昆虫产生抗药性的原因之一。在农药降解上,微生物菌剂的使用也可能导致害虫获得有分解农药的菌株,为防止用药量上的恶性循环,建议使用具有降解农药菌株的代谢产物进行农药降解,而不应直接使用微生物菌体。
参考文献:
[1]杨新玲. 2011年我国农药产量情况[J]. 农药学学报,2012(1):50.
[2]王永杰,李顺鹏,沈标. 有机磷农药乐果降解菌的分离及其活性研究[J]. 南京农业大学学报,2001,24(2):71-74.
[3]张韩杰,闫艳春. 农药残留及微生物在农药降解中的应用与展望[J]. 湖北植保,2004(1):31-35.
[4]虞云龙,樊德方,陈鹤鑫. 农药微生物降解的研究现状与发展策略[J]. 环境科学进展,1996(3):28-36.
[5]崔中利,李顺鹏. 化学农药的微生物降解及其机制[J]. 江苏环境科技,1998(3):1-5.
[6]仪美芹,王开运,姜兴印,等. 微生物降解农药的研究进展[J]. 山东农业大学学报:自然科学版,2002,33(4):519-524.
[7]魏敏,李玉江. 微生物降解土壤残留农药的研究进展[J]. 山东化工,2007,36(3):15-18.
[8]程国锋,李顺鹏,沈标,等. 微生物降解蔬菜残留农药研究[J]. 应用与环境生物学报,1998(1):82-85.
[9]Spychala J,Datta N S,Takabayashi K,et al. Cloning of human adenosine kinase cDNA:Sequence similarity to microbial ribokinases and fructokinases[C]//Proc.Natl,93.Sci.USA,1996:1232-1237.
[10]Müller C W,Schlauderer G J,Reinstein J,et al. Adenylate kinase motions during catalysis:an energetic counterweight balancing substrate binding[J]. Structure,1996,4(2):147-156.
[11]姜淑梅,张龙,戴世鲲,等. 一种简单、有效的适于PCR操作的放线菌DNA提取方法[J]. 生物技术,2007,17(1):39-41.刘楠,闫佳会,姚强,等. 青海省麦类黄矮病发生情况调查[J]. 江苏农业科学,2016,44(2):154-158.