摘要：对分离自内蒙古自治区浑善达克盐碱湖的一株杆菌菌株MIM18的培养特征进行了研究。结果表明，该菌为革兰氏阳性杆菌，粉红色，分泌过氧化氢酶、精氨酸双水解酶和赖氨酸脱羧酶，对常见的抗生素高度敏感。生长盐浓度为0～55 g/L，最适盐浓度为10 g/L；温度范围24～40 ℃，最适温度33 ℃；pH 6.0～11.0，最适pH 9.5。好氧，属于兼性嗜碱菌。
关键词：盐碱湖；兼性嗜碱菌；培养特征
中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2295-04
嗜碱菌是一类最适生长于pH大于或等于9的环境中的微生物，根据它们在pH 7 条件下生长与否可分为专性嗜碱菌和兼性嗜碱菌两大类[1，2]。对于嗜碱菌新菌株的分离、碱性蛋白酶的基因克隆和应用、极端环境适应机制、结构新颖的活性产物的分离都是当今极端环境微生物研究的热点[3-6]。嗜碱菌已广泛应用于发酵工业、石油化工、农作物生长改良和环境污染物的生物修复等多个领域[7，8]。目前，对嗜碱菌的嗜碱机理研究又有了新的重要突破[9]。
内蒙古有广阔的盐碱湖分布，蕴藏着丰富的微生物资源，其中嗜碱微生物呈现较高的生物多样性[10，11]。嗜碱菌有很高的经济价值和生产应用潜力，对其进行深入研究和开发利用，将成为我国战略生物资源的平台之一，有利于发挥生物技术创新的支撑作用。因此，对分离于浑善达克盐碱湖的一株嗜碱菌的基本特征进行了分析，以期为进一步认识和开发内蒙古地区的极端环境微生物资源奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 盐碱湖杆菌菌株 盐碱湖杆菌菌株MIM18由内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究所从内蒙古浑善达克盐碱湖中分离获得。
1.1.2 培养基
1）液体培养基。酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 10 g/L，微量元素1 mL/L，微生素 100 μL/L，pH 9～10。
2）固体培养基。在液体培养基中加入琼脂15 g/L制成。
3）半固体培养基。在液体培养基中加入琼脂4 g/L制成。
4）微量元素溶液配方（g/L）。FeCl3 0.05，MnSO4·H2O 0.02，H3BO3 0.01， CuSO4·5H2O 0.01，（NH4）6Mo7O24 ·4H2O 0.02，ZnSO4 0.01 g，EDTA 0.5，CaCl2·2H2O 0.2。
5）微生素溶液配方（g/L）。生物素 0.02，VB1 0.02，VB12 0.001，硫辛酸 0.05。
1.2 方法
1.2.1 形态特征和生长曲线的绘制 通过革兰氏染色和平皿划线培养的方法来观察MIM18的基本形态特征。将MIM18菌种接种于含100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，置33 ℃、200 r/min水浴摇床光照培养。隔时取样于600 nm处测定吸光度。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线。
1.2.2 耐盐试验 调整培养基中盐浓度分别为0、10、20、30、40、50、55、60 g/L。固体培养基平皿划线光照培养测定MIM18的耐盐程度；液体培养基（装液量为100 mL/（250 mL），接种量2%）33 ℃、200 r/min水浴摇床培养3 d后于600 nm处测定吸光度，每个梯度3个平行[12，13]。
1.2.3 pH对生长的影响 调整培养基的pH分别为5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、11.5、12.0，培养测定方法同1.2.2。
1.2.4 温度对生长的影响 采用含NaCl的培养基，分别置于0、24、27、30、33、36、40、42 ℃的条件下培养，培养测定方法同1.2.2。
1.2.5 氧气对生长的影响 半固体培养基穿刺培养，每12 h观察一次。观察菌体的生长情况及位置。液体静置和摇床培养，观察菌体在液体中的分布。
1.2.6 光照对产色素的影响 划线接种固体培养皿3个，两个平皿用锡箔纸包住避光培养，24 h后将锡箔纸中的一个平皿光照培养，另一个仍避光培养，第三个平皿一直光照培养。
1.2.7 产酶种类和抗生素敏感性分析 产酶种类测定参考《常见细菌系统鉴定手册》[14]和文献[15]中的方法进行。抗生素敏感性试验采用药敏纸片检测法[16]进行。
2 结果与分析
2.1 MIM18的生长曲线
通过7 d的恒温摇床培养和吸光度测定，绘制出MIM18的生长曲线（图1）。从图1可以清晰看到0～12 h为延滞期，12～72 h为指数生长期，72～120 h为稳定期，120 h后进入衰亡期。
2.2 盐浓度对MIM18生长的影响
经过培养，MIM18可在盐浓度0～55 g/L范围内生长。对比各盐浓度的生长状况发现，在盐浓度0～40 g/L时均能较好地生长。盐浓度为0 g/L时，菌落的颜色明显淡于盐浓度10～40 g/L时的菌落颜色（图2、图3）。盐浓度为50 g/L时，有少数菌落生长，盐浓度为55 g/L时只有5个左右的小菌落，盐浓度≥60 g/L时几乎不生长。说明低盐有利于MIM18的生长，过高的盐浓度将会抑制其生长。通过不同盐浓度培养后测定吸光度比较发现（图4），MIM18在盐浓度0～10 g/L范围内随着盐浓度升高有利于MIM18的生长，在盐浓度为10 g/L时生长情况最好；在盐浓度10～40 g/L时抑制MIM18的生长，但抑制效果不明显，当盐浓度为40 g/L以上时MIM18的生长明显受到抑制。
2.3 pH对MIM18生长的影响
经平板培养可知，MIM18适应pH变化能力较强，能在pH 6.0～11.0环境下生长。当pH≤5.5或≥11.5时该菌株不生长。当pH 6.0、7.0和11.0时该菌株生长比较缓慢；pH 8.5～10.0时MIM18生长随pH的增大逐渐加快，pH 9.5时最适生长，生长最快，也最先达到稳定期，之后生长量随pH增大而减小（图5）。
2.4 温度对MIM18生长的影响
经平板培养可知，MIM18的生长温度范围为24～40 ℃，大于40 ℃时不再生长。从图6可以看出，33～36 ℃为MIM18生长的适宜温度范围。
2.5 氧气对MIM18生长的影响
半固体培养基穿刺光照培养24 h后，穿刺孔上部有生长迹象，之后半固体斜面生长迹象加强，穿刺孔中生长迹象逐渐减弱直至消失；液体培养时，只在液面处生长，说明氧气是MIM18生长的必要条件，MIM18不具有运动性。摇床振荡培养与静置培养对比结果表明摇床培养条件下MIM18的生长状况明显优于静置培养，说明摇床培养提供的氧气对MIM18生长有重要作用。
2.6 光照对MIM18产色素的影响
如图7所示，3种光照处理方式下MIM18生长状况、菌落形态基本一致，说明光照对MIM18的色素合成乃至生长无影响。
2.7 MIM18的产酶种类和抗生素敏感性
经测定，该菌株在生长中产生接触酶（过氧化氢酶）、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶，不产生脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、酯酶；甲基红和硫化氢试验为阳性；它对常见的抗生素（青霉素-G、红霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、罗红霉素、多粘菌素、卡那霉素、妥布霉素、利福平、杆菌肽）均表现为高度敏感。
3 结论与讨论
MIM18在盐浓度0～40 g/L范围内都能较好生长，适应能力较强，甚至在无盐条件下也能生长，在盐浓度10 g/L时就能达到最适盐浓度，说明其生长对盐量要求不大，当盐浓度超过40 g/L时生长明显受到了抑制，因此MIM18不是嗜盐菌[10]；MIM18不仅能在强碱条件下生长而且能在pH 7下生长，因此是兼性嗜碱菌[11]。另外，MIM18在温度方面要求也不十分严格，30～36 ℃生长差异不是很大。MIM18对pH和周围环境的氧气量变化很敏感，氧气是其生长的必要条件，光照对其色素合成乃至生长没有影响。
嗜碱菌是盐碱湖中数量大、分布广的极端微生物。由于其独特的环境适应模式，特殊的生理机制，独特的基因类型，并有多种代谢产物可以利用，因而不仅成为了生命科学理论研究的理想材料，而且成为一类具有很大开发潜力的生物资源[17]。近年来，嗜碱微生物的研究发展迅速，已应用于诸如清洁剂生产[18]、生物表面活性剂[19]、农作物生长促进剂[20]和天然产物的生物转化、环境污染物降解[8，21，22]等多个方面。对盐碱湖菌的深入研究，不仅可以开发新的微生物基因资源，而且将大大促进微生物在人类健康、环境保护和生物技术等领域的利用。
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