摘要:以移栽二年生慈竹新生嫩枝为材料，通过喷洒GA3，研究其对慈竹木质素和纤维素含量动态积累及PAL活性的调控作用。结果表明，不同浓度GA3处理对木质素含量动态积累的调控效应不同，GA3处理可以改变慈竹木质素含量积累动态，较低浓度GA3具有降低木质素含量的作用。低浓度的GA3处理具有降低PAL活性的作用。不同浓度GA3处理对慈竹纤维素含量动态积累具有调控作用，100 mg•L-1 GA3处理的纤维素含量动态积累在试验范围内呈上升的趋势，而50 mg•L-1 GA3处理纤维素含量的积累则呈先上升而后下降的趋势。相关分析结果表明，GA3浓度与慈竹纤维素含量间呈极显著正相关(r=0.998 3)，木质素含量与PAL活性间呈极显著正相关(r=0.831 1)。
关键词:慈竹;木质素;纤维素;PAL活性
中图分类号:S795.5;Q539+.3;Q557+.3 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2008)08-0930-03
植物激素是植物发育和形态发生的重要调节因子，其对形成层的生长具有调节作用，如细胞分裂，细胞的伸长，最终细胞的形态学，诱导细胞分化成不同细胞类型和细胞壁化学组成等[1-4]。罗自生在竹笋木质化的研究中，发现外源GA3处理能增加内源GA3含量，降低ABA/GA3的比值，并抑制PAL，C4H和POD活性的上升，降低木质素含量和硬度，从而延缓竹笋木质化的进程[1]。刘尊英用GA3处理采后的绿芦笋，其木质素含量增加较为缓慢，贮藏过程中木质素含量始终低于对照;同时，用赤霉素处理采后豌豆苗，经过处理后豌豆苗中粗纤维含量显著受到了抑制，木质化进程也受到了抑制[2]。有关GA3对慈竹木质素和纤维素形成及调控木质素生物合成关键酶活性的作用鲜见报道。因此，本研究以四川省典型丛生慈竹为材料，通过喷洒外源GA3，研究其对慈竹木质素和纤维素含量动态积累及PAL活性的调控作用。
1 材料与方法
1.1 样品的采集及制备
将二年生生长健壮且无病虫害的慈竹于2005年3月进行移栽，行长和行距分别为1.5 m，移栽时留下约1 m高的竹桩，为保证成活率，在竹桩顶端灌入清水。待移栽成活并有新枝､新叶发出并生长茂盛后，竹枝长约40 cm，用0 mg•L-1､50 mg•L-1､100 mg•L-1的GA3分别喷施于竹丛冠层叶表面，每平方米喷施100 mL，每个处理3次重复。以喷洒蒸馏水的为对照。喷洒后定期将新萌发的枝条剪掉，以保证试验的准确性。
从喷洒赤霉素开始，分别于喷洒后60､120和180 d的上午进行采样。采集处理方法如下:每一丛上剪取生长粗壮､长短相似的枝条，摘下叶片迅速储藏到冰盒中。每个样品的枝条分成两部分储藏，一部分迅速剪成小段，于液氮中，30 min后转移到
-86℃超低温冰箱中保存待用;一部分105℃杀青。
1.2 木质素含量测定
参照国家标准GB2677.8-81进行测定。将杀青烘干至恒重的样品放入植物粉碎机中粉碎，过60目筛。将过筛后的样品竹粉放入索氏抽提器中，用苯∶醇=1∶2(1体积的苯和2体积的乙醇混合配成)溶解;取出样品，110℃烘干3 h;万分之一电子天平准确称取200 mg的样品放入试管中，加入4 mL的72%硫酸;塞紧试管塞放入40℃的水浴锅中1 h，并每隔10 min摇动试管;然后将试管中的样品移到250mL锥形瓶中，加入112mL蒸馏水;在100℃下冷凝回流1 h;混合液经过真空抽提泵砂芯漏斗过滤，并用500 mL热水冲洗直至滤液pH为中性;在110℃高温下烘1 h以上，直至恒重。这样就得到了慈竹的木质素。每个样品重复3次。先将砂芯漏斗烘干，在万分之一电子天平上精确称量到万分之一位，并记下数据W1。在提取出木质素后，连同木质素和砂芯漏斗一起称量，同样也精确到万分之一位，记下数据W2。最后木质素含量=W2-W1。
1.3 综纤维含量测定
参照国家标准GB2677.10-81进行测定。准确称取2 g烘干样品置于三角瓶中，加65 mL蒸馏水､0.5 mL冰乙酸和0.6g NaClO2(亚氯酸钠)摇匀，75℃恒温水浴，间隔混匀;1 h后再加入0.5 mL冰乙酸和0.6 g NaClO2摇匀，继续75℃恒温水浴1 h，如此反复，直到试样变白即可，即木质素含量在2%~4%;三角瓶冷却后，将全部残渣移入砂芯漏斗(30 mL)，用循环水真空泵进行抽滤，冷水冲洗至滤液pH值为中性，用丙酮洗3次，然后将砂芯漏斗连同残渣一同放入110℃电热鼓风干燥箱烘至恒重，利用万分之一电子天平测残渣质量。综纤维素含量为最后每克样品中残渣所占的毫克数，每个样品3次重复。
1.4 PAL活性测定
参照Koukol等的方法进行测定[7]。①粗酶液的提取。取不同处理样品各0.1 g，放入冰冻好的干燥研钵中。加入相当于样品50倍的预先配制好的缓冲液(含0.2 mol•L-1硼砂，含0.005 mol•L-1的巯基乙醇，0.001 mol•L-1的EDTA，pH8.0)，加入相当于样品1/10重量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。于冰浴中将样品研磨匀浆，将匀浆好的样品转入1.5 mL的EP管中，用3管进行分装。于4℃下，10 000 r•min-1，离心15 min，将相同样品不同管的上清液转入同一大型EP管中充分混匀，然后放入4℃冰箱中待用。②酶活性的测定。取底物溶液(为L-苯丙氨酸0.02 mol•L-1，配制时用硼砂缓冲液进行溶解)1 mL，缓冲液2 mL，0.8 mL粗提酶液，混合后放入大型离心管中，于37℃水浴锅反应1 h。分别取各种反应液1 mL，在290 nm波长下测定吸光度值。对照用缓冲液代替底物(L-苯丙氨酸)溶液。酶活力单位为0.001A290 •g-1FW•h-1。每个样品设3次重复。
2 结果与分析
2.1 GA3对慈竹木质素动态积累的效应
不同浓度的GA3处理对木质素含量动态积累的调控效应不同。在喷洒GA3 60 d后，50 mg•L-1和100 mg•L-1处理的木质素含量都明显高于0 mg•L-1处理。到120 d时，50 mg•L-1处理的木质素含量缓慢上升，尔后快速下降，到180 d时达到最低，明显低于另两个处理;而100 mg•L-1处理的木质素含量，则快速下降，到120 d时，达最低谷，然后快速回升，到180 d时，其木质素含量与0 mg•L-1处理的无明显差异。0 mg•L-1处理的木质素含量在本试验范围内呈上升的趋势(图1，表1)。研究结果表明，GA3对慈竹茎杆木质素含量动态积累具有调控作用。GA3处理可以改变慈竹木质素含量积累动态，而且喷洒较低浓度GA3具有降低后期木质素含量的作用。
2.2 GA3对调控慈竹木质素生物合成酶PAL活性的效应
由图2可以看出，不同浓度GA3处理对PAL活性动态的调控效应不同。50 mg•L-1 GA3处理，在喷洒后60 d时，PAL活性高于其他两个处理，随着生育期的延长，其活性呈降低的趋势，到180 d时，其活性低于100 mg•L-1 GA3的处理，而高于无GA3的处理。无GA3处理的PAL活性的变化动态与50 mg•L-1 GA3处理的相同，只是每一时期PAL活性均低于50 mg•L-1 GA3的处理。而100 mg•L-1 GA3处理PAL活性的变化动态与50 mg•L-1 GA3处理的相反，呈上升的趋势，在喷洒GA3 60 d和120 d时，PAL活性都低于其他两个处理，而且PAL活性变化比较缓慢，但120 d后，到180 d时，其活性却高于其他两个处理，而且其活性的增长速度很快。由此可以看出，低浓度的GA3处理具有降低PAL活性的作用。
2.3 GA3对慈竹纤维素动态积累的效应
不同浓度的GA3处理对慈竹纤维素含量的动态积累具有调控作用，但调控的效应不同。经GA3处理60 d后，其纤维素含量都明显地高于0 mg•L-1 GA3的处理(图3，表2)。60 d至120 d时，50和100 mg•L-1 GA3处理的纤维素含量增长比较缓慢，而0 mg•L-1 GA3处理纤维素含量的积累却呈快速的增长，到120 d时，其纤维素含量与50 mg•L-1 GA3处理的无明显差异，但与100 mg•L-1 GA3处理的差异达极显著水平。120 d后，0 mg•L-1 GA3处理和100 mg•L-1 GA3处理的纤维素含量的积累仍呈增长的趋势，但增长的速度比较慢，到180 d时，其含量都明显高于50 mg•L-1 GA3处理;50 mg•L-1 GA3处理纤维素含量的积累则呈缓慢降低的趋势。总之，0 mg•L-1 GA3处理和100 mg•L-1 GA3处理的纤维素含量动态积累在本试验范围内呈上升的趋势，而50 mg•L-1 GA3处理纤维素含量的积累则呈先上升而后下降的趋势。
2.4 GA3浓度､木质素含量､纤维素含量和PAL活性间的关系
相关分析结果表明，GA3浓度与木质素含量和PAL活性之间分别呈不显著的正相关(r=0.194 1)和负相关关系(r=-0.384 0)，但与慈竹纤维素含量间呈极显著的正相关关系(r=0.998 3**)。表明GA3处理有提高慈竹纤维素含量的作用;但对木质素含量的作用很不明显，对PAL活性的作用虽呈不明显的负相关关系，但GA3对PAL活性的作用程度要高于对木质素含量的作用。木质素含量和PAL活性间呈极显著的正相关关系(r=0.831 1**)，表明PAL活性的增加可以明显提高木质素的含量。
3 小结与讨论
植物激素作为一种微量信号分子，对植物整个发育和基因的表达具有调控作用。研究表明，GA3能促进棉纤维细胞的分化，也能刺激纤维使其有一定程度的伸长[5]。王学东等用赤霉素处理亚麻后发现，赤霉素对亚麻生长发育有较大影响，可显著提高亚麻纤维的各项生理指标，喷施赤霉素可使纤维细胞直径明显增粗，从而使纤维产量获得提高[6]。本研究认为，喷施GA3对慈竹纤维素含量及其动态积累具有调控作用，并能提高纤维素含量。相关分析结果进一步证明了这点，但喷施不同浓度GA3对慈竹纤维素含量动态积累的调控趋势不同。前人研究表明，经外源GA3处理后的竹笋木质素含量有不同程度的降低[7]。本研究认为，GA3处理不仅可以改变慈竹木质素含量积累动态，而且喷洒较低浓度GA3具有降低木质素含量的作用。植物激素对木质素合成相关酶有重要的调控作用，植物激素通过调控这些酶的活性从而达到对木质素合成的调控[1-4]。Sophia等将拟南芥中编码赤霉素合成的基因GA20-oxidase(AtGA20-ox)和GA2-oxidase(AtGA2-ox)克隆到烟草中后发现，GA20-oxidase(AtGA20-ox)和GA2-oxidase(AtGA2-ox)基因对合成途径中上游的PAL影响不大[4]。本研究认为，低浓度的GA3处理具有降低PAL活性的作用，从而对降低木质素含量起到一定的调控作用。
参考文献:
[1] 罗自生. GA3处理对采后竹笋木质化及内源激素水平的影响[J]. 园艺学报，2005，32(3):454-457.
[2] 刘尊英. 绿芦笋木质化的生理生化基础及其调控技术研究[D]. 北京:中国农业大学，2003.
[3] 宾金华，潘瑞炽. 茉莉酸甲酯诱导烟草幼苗抗病与过氧化物酶活性和木质素含量的关系[J]. 应用与环境生物学报，1999，
5(2):160-164.
[4] SOPHIA B，HENNING T，UWE S. Impact of alered gibberellin metabolism on biomass accumulation， lignin biosynthesis， and photosynthesis in transgenic tobacco plants[J]. Plant Physiol，2004，135:254-265.
[5] 孙振元，郑湘如，徐楚年，等. 吲哚乙酸和赤霉酸在离体棉花胚珠生长和纤维发育中的作用[J]. 北京农业大学学报，1992(增刊):129-135.
[6] 王学东，李 明，崔 琳，等. 赤霉素对亚麻纤维发育及产量的影响[J]. 中国麻业，2002，24(3):13-14.
[7] KOUKOL J，CONN E E. The metabolism of aromatic compounds in higher plants: Purification andproperties of the-phenylalanine deaminase of Herdeum vulagare[J]. Journal of Biology and Chemistry，1961，236:2 692-2 698.