摘要：通过研究超声波辅助酶法提取马尾藻多糖的最佳条件，为提高马尾藻的利用率提供理论依据。采用响应面分析优化酶解法提取多糖工艺与正交优化超声波破碎工艺，得到超声波辅助酶法提取多糖的最佳提取条件。结果表明：超声波辅助酶法提取马尾藻多糖最佳条件为：超声波作用时间40min，功率350W，工作温度80℃，酶解温度44.95℃、酶解pH5.0、酶解时间2.05h，酶添加量2.5%，所得马尾藻多糖提取率为17.43%，比单独酶解法提取马尾藻多糖提高了3.41%。
关键词：超声波；酶解；马尾藻多糖；提取
中图分类号：TQ914.2 文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-12-0071-3
马尾藻(Sargassum)是褐藻门鹿角菜目马尾藻科植物，盛产于我国黄海、渤海沿岸各地，资源十分丰富[1]。马尾藻多糖是从马尾藻中提取出来的一种易溶于水、黏度较高的多糖复合物,属于海藻多糖[2]。国内外的学者研究表明海藻中分离的多糖具有抗辐射、抗凝血、抗肿瘤和抗病毒等多种生物活性，还具有降血脂、抗氧化、免疫调节等作用，海藻多糖衍生物可作为细胞物质的寒冷保护介质[3-5]。马尾藻多糖具有广泛的实际使用价值，因此如何提高马尾藻多糖的提取率具有重要意义。
马尾藻多糖的提取方法主要有热水浸提法、酶解法、超声波破碎法。热水浸提法耗时长，得率低；近年来，随着超声波技术被广泛的应用于真菌、植物组织中活性物质的提取，不少研究人员也将其运用于真菌多糖的提取[6-8]，但得率仍不够理想；而酶降解具有专一性、高效性、降解条件和过程易于控制、无副反应等优点，应用日益增多[9]。在确定酶解最佳条件后，对马尾藻进行超声波破碎，再进行酶解，比较酶解法提取多糖与超声波酶解法提取多糖的得率，为提高马尾藻多糖提取率的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂 马尾藻，采购于山东省；苯酚、98%浓硫酸、3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖、四水合酒石酸钾钠、氢氧化钠等，以上试剂均为国产分析纯；纤维素酶(酶活力15U/mg)上海生化科技有限公司。
1.1.2 仪器 DS-1高速组织捣碎机，上海标本模型厂；HHSZ1-6电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂；RE-52系列旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂；DT系列电子天平 美国双杰有限公司；PHS-3C型pH计 北京雷磁仪器厂；LDZ4-2型低速自动平衡离心机 北京雷勃尔有限公司；722S型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份。
1.2 方法
1.2.1 多糖测定苯酚-硫酸法
马尾藻多糖提取率（%）=多糖含量/干马尾藻粉质量×100%
1.2.2 酶法提取马尾藻多糖工艺 马尾藻—晾干—磨碎—加入适量蒸馏水—调pH—酶解—调酶解温度—灭活—4000r/min离心10min—取上清液加入95%乙醇萃取—4000r/min离心10min—马尾藻多糖
1.2.3 超声波辅助酶法提取马尾藻多糖工艺 马尾藻—晾干—磨碎—超声处理—加入适量蒸馏水—调pH—酶解—调酶解温度—灭活—4000r/min离心10min—取上清液加入95%乙醇萃取—4000r/min离心10min—马尾藻多糖
2 结果与分析
2.1 提取工艺单因素实验结果
以纤维素酶为酶解剂，在其他条件一致的情况下，分析酶添加量、酶解温度、酶解时间及酶解pH值等因素对马尾藻多糖提取率的影响。
2.1.1 酶解温度的确定 在酶解时间为2h、pH值为5、纤维素酶添加量1.5%时，调纤维素酶的酶解温度为：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。记录不同酶解温度对马尾藻多糖提取率的影响。结果见图1。
如图1所示，当温度低于45℃，随着温度的升高，马尾藻多糖提取率增加，当温度高于45℃时，提取率反而下降。这是由于温度升高，酶活力受到影响，酶解能力下降[10]，提取率随之下降，故选择45℃作为提取的最适温度。
2.1.2 酶解时间的确定 在酶解温度为45℃、pH值为5、纤维素酶添加量1.5%时，调纤维素酶的酶解时间为：1h、1.5h、2h、2.5h、3h。记录不同酶解时间对马尾藻多糖提取率的影响。结果见图2。
如图2所示，随着酶解时间的延长，马尾藻多糖的提取率不断增加。酶解2h时提取率最高，之后提取率逐渐下降，并呈平缓趋势，这可能是酶解时间越长酶活力之间降低的原因[11]，因此选择酶解2h为最佳酶解时间。
2.1.3 酶解pH值的确定 在酶解温度为45℃、在酶解时间为2h、纤维素酶添加量1.5%时，调纤维素酶的酶解pH为：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。记录不同酶解pH对马尾藻多糖提取率的影响。结果见图3。
从图3可以看出当pH低于5时，提取率很低，因为纤维素酶属于微酸性蛋白酶，在酸性很强的环境下酶活力降低导致马尾藻多糖提取率低，但是在pH值达到5以后提取率不再增加，开始逐渐下降，这是由于纤维素酶在碱性环境中酶活力降低并会逐渐失活的缘故。因此酶解的最适pH为5。
2.1.4 酶添加量的确定 在酶解温度为45℃、在酶解时间为2h、酶解pH值为5时，调纤维素酶的添加量为：0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%。记录不同酶添加量对马尾藻多糖提取率的影响。结果见图4。
从图5可以看出酶添加量在达到2.5%时，提取率达到了最大。随着酶添加量的增加，马尾藻多糖取率逐渐增加，并没有下降趋势，但考虑到效益因素，没添加量达到2.5%后不再继续添加，选择2.5%为最佳酶添加量。
2.2 响应面分析法对马尾藻多糖提取率的优化
2.2.1 响应面分析因素水平的选取 根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素影响试验结果，选取酶解温度、酶解pH、酶添加量对马尾藻多糖提取影响显著的3个因素，在单因素试验基础上采用三因素三水平的响应面分析方法，因素与水平见表1。响应面分析方案及结果见表2。
2.2.2 响应面试验设计及结果
利用Design expert V 8.0.4 统计软件对表2数据进行回归拟合，得到拟合，得到马尾藻多糖提取率（Y）对以上4个因素的二次多项回归模型为：
Y/%=613.97+0.17X1－0.066X2－0.46X3－1.82X1X2－1.56X1X3－1.97X2X3－1.73X12－2.21X22－2.90X32
2.2.3 模型方差分析 利用Design Expert V 8.0.4统计软件进行二次多元回归拟合，得到回归方程模型的方差分析和回归方程系数估计值，见表3。由表3可知，模型具有高度显著性(P＜0.0001)，失拟项P=0.0252<0.05不显著，又由各因素的P值可知除X2对马尾藻多糖提取率的影响不是很显著外，其他几项对提取率的影响都有明显的显著性，由此可见响应值的变化相当复杂，各个具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。R2=0.9425较大，说明二次多项式回归效果比较好；失拟项不显著，说明回归方程拟合程度良好。
回归模型预测的酶法提取马尾藻多糖的最佳工艺条件为酶解温度44.95℃、酶解pH5.0、酶解时间2.05h，此时纤维素酶提取马尾藻多糖的提取率的理论值达到了14.00%。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行马尾藻多糖的提取， 结果得出马尾藻多糖提取率的实际值为13.98%。与理论预测值14.00%非常接近。因此，基于响应面法分析所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。
2.3 超声波辅助酶法提取马尾藻多糖最佳条件的优化
确定酶解最佳条件后，在酶解最佳条件下以多糖提取率为指标，研究超声功率、超声时间和提取温度这3个因素对提取的影响，确定出最佳工艺。L9(33)超声波提取正交实验因素水平如表4所示，超声波提取正交实验结果见表5。
由极差分析的结果可知，上述3因素对超声波法提取多糖的影响程度为：A>C>B，正交优化条件为A2B1C2，即超声波作用时间为40min，功率为350W，工作温度为80℃。超声波辅助酶法的多糖提取率为17.43%，比酶解法提取的13.98%提高了3.41%。
3 结论
超声波辅助酶法提取马尾藻多糖的最佳工艺参数为：超声波作用时间为40min，功率为350W，工作温度为80℃，酶解温度44.95℃、酶解pH5.0、酶解时间2.05h，酶添加量2.5%，在此条件下的多糖提取率为17.43%比酶解法提高了3.41%。具有一定的实际应用价值。
参考文献
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作者简介：张丹鹤（1984-），女，吉林长春人，吉林农业大学研究生学院水产品加工与贮藏工程专业2009级硕士研究生，研究方向：水产品加工；秦小冬（1980-），男，吉林长春人，吉林农业大学研究生学院思想政治教育专业2009级硕士研究生，研究方向：高等学校德育研究。