摘要 [目的]优化石榴皮有效抑菌部位的萃取工艺。[方法]采用超声辅助萃取法，选取纯水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷6种溶剂萃取石榴皮抑菌药液。通过琼脂平板法测定石榴皮抑菌药液对9株水产常见致病菌的最低抑菌浓度，正交试验方法考察溶剂浓度、料液比、温度、超声时间对抑菌率的影响，进一步优化石榴皮抑菌药液的萃取工艺。[结果]比较不同溶剂抑菌效果，表明乙醇为最佳萃取溶剂，其萃取部位平均最低抑菌浓度为0.517 mg/mL。在
乙醇体积分数70%、料液比1∶20 g/mL、萃取温度60 ℃、超声时间40 min的最佳萃取工艺条件下，萃取药液平均最低抑菌浓度为0.442 mg/mL。[结论]研究可为石榴皮在水产养殖细菌性疾病防控中的应用和石榴皮抗菌剂的研制及工业化生产提供理论依据。
关键词 石榴皮；超声辅助萃取；抑菌；正交试验
中图分类号 S609.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）06-109-04
随着水产高密度养殖的迅猛发展，养殖病害的发生率越来越高，对水产养殖业的健康可持续发展造成严重威胁。细菌性疾病由于发病快、感染率高，是养殖鱼类中最常见的一类疾病[1]。长期使用抗菌化学药物会给养殖环境和水产品带来重大安全隐患，结合我国实际，采用中药进行鱼类细菌性疾病防控的研究具有广阔的应用前景[1]。石榴皮所含的化学成分，如黄酮类[2]、生物碱类[3]、有机酸类、鞣质类[4]、石榴多酚[5]等，均具有抗菌[6] 、抗氧化[7]、抗衰老[7]等生理和药理活性，对绿脓杆菌[8]、溶血链球菌[9]、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和志贺痢疾杆菌等致病菌具有很好的抑制作用。但是中药在渔药中的运用由于缺乏提取工艺研究而受到一定限制。超声波萃取法是利用超声波辐射产生强烈的空化效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌等多种作用，加快物质分子运动的频率和速度、增大溶剂的穿透力，加速了目标成分进入溶剂。与传统萃取方法相比，超声波萃取法具有溶剂用量少、萃取时间短、萃取率高[10]、不影响有效成分活性、不改变萃取有效成分的化学结构等优点，大大提高了萃取效率[11]。笔者拟利用超声波萃取法比较不同溶剂萃取石榴皮有效抑菌药液，优化超声萃取的条件，以期为水产养殖用抗菌剂的研制和实际生产应用提供科学的试验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株。
9株致病菌均为鳗鱼现代产业技术农业部工程研究中心近年从漳浦、莆田、同安、集美等养殖场病鳗中分离得到，并经过人工感染试验证实为致病菌，其中Sh28为枸橼酸杆菌，Sh29为鼠疫耶尔森菌，Sh211为鲁克耶尔森菌，B10为嗜水气单胞菌，B36为迟缓爱德华菌，G16为奇异变形菌，F34为舒伯特气单胞菌，FJ0507为创伤弧菌，Sh1为类志贺邻单胞菌。
1.1.2 药材与主要试剂。
石榴皮，产地甘肃；MH肉汤，山东青海高科园海博生物技术有限公司；氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉，广东环凯微生物科技公司。
1.1.3 主要仪器。
中草药粉碎机（FW177型），天津市泰斯特仪器有限公司；超净工作台（AIRTECH型），天津钧星瑞科技有限公司；高压灭菌锅（高压灭菌GI54DS型），AUTOCLAVE；超声破碎仪（KQ300TDE型），昆山市超声仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 药材的粉碎与超声波萃取。
将石榴皮用中草药粉碎机粉碎，用200目的筛网过滤，收集过筛后的超微药粉，备用。根据下列Ⅰ～Ⅳ方案配制单溶剂萃取溶剂[11]，再根据Ⅴ、Ⅵ 2种方案配制双水相萃取溶剂，浸泡30 min，然后在超声萃取仪下萃取60 min，条件为变幅杆6 mm，超声功率720 W，温度50 ℃，超声3 s，间歇5 s，萃取后离心取上清液，经过滤，去除药渣，将滤液置于多样品平行蒸发仪中减压浓缩，得到粗提浸膏，4 ℃保存备用。
方案Ⅰ：60%（体积分数）乙醇[12]，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅱ：70%（体积分数）甲醇[13]，料液比1∶30 g/mL、60 ℃；方案Ⅲ：62%（体积分数）丙酮[13]，料液比1∶30 g/mL，60 ℃；方案Ⅳ：正己烷，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅴ：纯水，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅵ：60%（体积分数）乙醇+0.325 mg/mL硫酸铵，料液比1∶20 g/mL，60 ℃；方案Ⅶ：60%（体积分数）乙醇+10%（体积分数）乙酸乙酯，料液比1∶30 g/mL，60 ℃。
1.2.2 菌悬液的制备。
先将9株致病菌进行分离纯化后，于普通琼脂培养基斜面中划线培养，置于28 ℃恒温培养箱培养24 h ；然后将菌种冲洗下，取菌液200 μL加入2 mL生理盐水，取已稀释菌液200 μL于酶标板，以生理盐水为空白对照，用酶标仪测定吸光度值，吸光度值范围为0.18～0.30时，菌浓度已校正为108 CFU/mL；再将已校正的108 CFU/mL菌液与生理盐水按1∶9混合稀释成107 CFU/mL。
1.2.3 药物敏感试验。
药敏培养基均经过高压灭菌后倒平板，将菌液浓度调至107 CFU/mL，取菌液2 μL接种在含药平板上，每个药物梯度做2组平行试验。将接种的平板放置28 ℃培养箱培养，24和48 h后分别观察平板上菌落的生长情况，记录其最小抑菌浓度（MIC）[14]。
1.2.4 正交试验设计。
选出萃取物抑菌效果最好的溶剂乙醇，采用正交试验设计法优化石榴皮超声波萃取条件，设置16组4水平4因素正交试验，以萃取溶剂乙醇的浓度、料液比、萃取温度和超声波处理时间为4个因素，每个因素选择4个水平，利用SPSS软件设计正交试验表进行正交试验。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂萃取石榴皮药液的抑菌作用比较
由表1可知，乙醇萃取的石榴皮药液对Sh211、F34、FJ0507 3株致病菌的抑制效果最佳，MIC为0.225 mg/mL；甲醇萃取的石榴皮药液对F34的抑制作用最强，MIC为0.375 mg/mL；丙酮萃取的药液对B10、F34的抑制效果最好，MIC为0.375 mg/mL；正己烷萃取的石榴皮药液对9株致病菌的抑制效果不明显，仅对Sh28、Sh1、FJ0507的MIC<1.0 mg/mL；而用蒸馏水萃取的石榴皮药液仅对Sh28、Sh1、Sh211、FJ0507的MIC<1.0 mg/mL。从平均最低抑菌浓度来看，乙醇萃取石榴皮药液对9株致病菌的抑制效果最好，平均MIC为0.517 mg/mL。为了进一步提高乙醇萃取药液对9株致病菌的效果，该试验采用乙醇分别与硫酸铵和乙酸乙酯组成双水相体系（Ⅵ、Ⅶ）进行萃取液抑菌试验，但是结果表明，2种双水相体系萃取石榴皮有效组分的抑菌效果不如单用乙醇作为萃取溶剂，故该试验选择乙醇作为超声萃取的最佳溶剂，后续进一步优化其萃取工艺条件。
2.2 正交试验结果分析 正交试验因素水平设计见表2，结果见表3。
从表3可见，组合9对7株菌的抑菌效果最佳，平均MIC为0.700 mg/mL，组合3对6株菌的抑菌效果最好，平均MIC为0.725 mg/mL，组合2、4对3株菌的抑菌效果最好，平均MIC为0.825、0.875 mg/mL，组合5、10只对1株菌的抑菌效果最好，平均MIC为0.875、0.950 mg/mL。其余组合效果不明显，平均MIC≥1.0 mg/mL。从均值来看，组合9即乙醇体积分数为70%、萃取时的料液比为1∶40 g/mL、萃取温度为60 ℃、超声时间40 min抑菌效果最好，为更准确得出最佳萃取工艺条件，笔者将对数据进行极差、方差分析。
2.2.1 极差分析法。
极差分析法是通过比较极差的大小进而确定因素的主次。特别指出，对于空白列也需要计算极差，并且要与其他因素的极差进行比较。若所有因素的极差都比空白列极差还小，则说明因素之间可能存在有不可忽略的交互作用，或是忽略了对试验结果有重要影响的其他因素。
由表4中极差（R）可知，各因素对石榴皮抑菌药液的萃取率的影响次序大小依次为A、D、C、B，即试验因素的主次顺序依次为乙醇浓度、超声萃取时间、萃取温度、料液比。故必须控制主要因素在最优水平上，对于次要因素则可在一定范围内选取适当水平。
2.2.2 方差分析法。
由于极差分析法存在一定的局限性，不能估计试验过程及试验结果测定中必然存在的误差，因而不能区分某因素各水平所对应的试验结果的差异究竟是由于水平的改变所引起的，还是由试验误差所引起的。所以该项目还采用方差分析法来弥补极差分析法的不足。
方差分析法能把因素水平的变化所引起的试验结果间的差异与误差的波动所引起的试验结果间的差异区分开，并能给出可靠的数量估计。该项目通过使用SPSS对试验结果进行方差分析得到结果如下：F校正模型=10.262，P校正模型=0.040；
F截距=3 840.585，P截距=0.000；FA=13.244，PA=0.031；FB=5.488，PB=0.098；FC=10.366，PC=0.043；FD=11.951，PD=0.036；R2=0.976；因变量为平均抑菌浓度。由各因素的平方和可得出各因素的主次顺序为A>D>C>B。
同样的抑菌效果条件下，选择的乙醇浓度均值越低越省化学药品。由此可见，选择水平3即乙醇体积分数为70%是最佳参数。其他因素的方差分析结果见表6。
同理从表6可见，最佳萃取工艺参数为萃取时的料液比为1∶20 g/mL、萃取温度为60 ℃、萃取时间40 min。从结果可以看出，极差分析和方差分析结果一致，更加证明了试验结果的准确性。
2.3 最佳工艺条件的验证试验
采用正交试验最佳水平进行验证试验，结果（表7）表明：在该条件下对9株常见致病菌的平均抑菌浓度为0.442 mg/mL，比未优化前的抑菌效果有了一定提高。
3 结论与讨论
石榴皮是农产品的废弃物，但却是一种常用的、廉价的抑菌中草药，其中富含多种生物活性物质，如酚类和鞣质、黄酮、生物碱、糖苷等，这些物质均具有抑菌作用[15]。该试验采用不同溶剂做单因素试验研究超声萃取石榴皮的有效抑菌药液对常见致病菌的抑菌活性，结果表明，乙醇为最佳萃取溶剂，其萃取部位MIC为0.517 mg/mL。进而通过4因素4水平正交试验得出最佳提取条件：乙醇体积分数为70%、萃取时的料液比为1∶20 g/mL、萃取温度为60 ℃、超声时间40 min，MIC为0.442 mg/mL。影响抑菌效果的大小次序为乙醇浓度、超声萃取时间、萃取温度、料液比。这是因为乙醇穿透细胞能力强，对难溶于水的亲脂性成分溶解性能好，与甲醇相比无毒、安全。其次，随着时间推移，提取率增加，再增加时间因细胞内外达到平衡，对有效成分溶出无明显影响。再次，温度增高使分子运动速度加快，渗透、扩散、溶解的速度也加快，但杂质的溶出也相应增加，而过高的温度会使有效成分氧化分解而遭到破坏[16]。最后，过低的料液比导致材料的浪费及有效成分溶出不彻底，而过高又会使得杂质溶出增大。
根据正交试验结果表明，石榴皮抑菌药液对9株致病菌的平均抑菌浓度范围在0.70～1.35 mg/mL，造成这种差异的原因可能是由于不同致病菌对石榴皮药液中所含有效抗菌成分的敏感度不同，且不同提取工艺对石榴皮提取液中所含的抑菌成分及浓度有所不同，因此在使用中药防治鱼类疾病的实践中， 应该先诊断致病的细菌种类， 再根据致病菌的种类来确定用药量。
超声萃取的有效抑菌药液有待于通过具体的定性及定量分析，进一步确定抑菌成分，以期为今后研究中草药联用以及中西药复方提供基础数据，并为石榴皮抗菌剂的研制和工业化生产提供参考。
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责任编辑 陈红红 责任校对 况玲玲