摘要：以黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）为代表的白腐真菌，其分泌的木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）等酶系能降解木质素以及前体类似物。对几种无机金属离子、无机阴离子、有机小分子对黄孢原毛平革菌所产酶系中的木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的酶活性影响进行了分析。结果表明，Fe3+对木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）都有很强的抑制作用，Fe2+、Ca2+对木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）表现出不同的促进作用，Br-比Cl-的激活作用稍弱；在添加乙二胺四乙酸（EDTA）或抗坏血酸的条件下，限氮培养比富氮培养更能提高出发菌株和诱变菌株的酶活力。
关键词：黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）；木质素过氧化物酶；锰过氧化物酶；酶活力
中图分类号：O629.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2878-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.017
Impact of Inorganic Ions and Organic Small Molecules on Enzymatic
Activity of Phanerochaete chrysosporium
CHEN Ying，YANG Wei-qiu，QIU Xue-lin，LIN Hui-fei
（Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture， Suzhou 215008， Jiangsu， China）
Abstract：As the representative of White-rot Fungus，Phanerochaete chrysosporium can secrete Lignin peroxides and Manganese peroxides and so on，which can depredate Lignin and Precursor analogs. Through using Inorganic ions and Organic molecules as Activator， enzyme activity in different conditions was researched.The results show that Fe3+ on LiP and MnP had strong inhibitory effect，but Fe2+ and Ca2+ on those showed different promoting effect. Br- can improve the enzyme activity better than Cl-. In addition of EDTA or ascorbic acid conditions，the nitrogen limited culture than nitrogen rich culture can improve the enzyme activity of the strains.
Key words：Phanerochaete chrysosporium；lignin peroxides；manganese peroxides；enzymatic activity
木质素是一类以苯丙烷为基本结构单元构成的复杂的芳香族高分子化合物，广泛存在于植物细胞中，是地球上仅次于纤维素的最为丰富的有机再生资源。木质素在植物体内通过化学键和半纤维素连接，然后包裹在纤维素外，形成木质纤维素。木质素由于具有各种生物学稳定的复杂键型而不易被微生物降解。要解决如何高效利用木质纤维素这一问题，关键在于如何降解包裹在纤维素晶体外面的木质素以及半纤维素，从而增加纤维素表面积，使纤维素易于降解和利用[1]。随着人类可利用资源的越来越紧缺，木质素的微生物降解成了当今研究的热点。白腐真菌作为已知的惟一可独立降解木质素的微生物，其能分泌木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）等酶降系统[2-8]。黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）是常见的白腐真菌之一，在其整个生长阶段中，木质素过氧化物酶的合成量要比锰过氧化物酶大得多，其在木质素降解中起主要作用。几乎所有的木生白腐菌和各种土壤中的枯叶分解真菌都能产生锰过氧化物酶，其是最为普遍的木质素修饰过氧化物酶[9-11]。
本试验研究了几种无机金属离子、无机阴离子、有机小分子对黄孢原毛平革菌所产酶系中的木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的酶活性影响，以期为大规模应用提供一定的参考数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种 黄孢原毛平革菌购于中国科学院微生物研究所。
1.1.2 培养基 固体PDA培养基： 土豆浸出液200 g，葡萄糖20 g， 琼脂20 g； 液体培养基： 葡萄糖（碳源）10 g/L、 酒石酸铵（氮源）1.2 mmol/L、 醋酸-醋酸钠缓冲液0.2 mol/L、 KH2PO4 2.0 g/L、 CaCl2 0.130 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、吐温-80 0.5 g/L、维生素A 0.4 mmol/L以及微量元素混合液10 mL；微量元素混合液： MnSO4 2.9 mmol/L、CaCl2 1.0 mmol/L、NaCl 0.15 mmol/L、 NaBr 0.15 mmol/L、ZnCl2 0.345 mmol/L、 FeSO4 0.358 mmol/L、 CuSO4 0.4 mmol/L、CoCl2·6H2O 0.458 mmol/L、 KAl（SO4）2·12H2O 0.022 mmol/L、 HBO3 0.16 mmol/L、 NaMoO4·2H2O 0.042 mmol/L，抗坏血酸10 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）10 mL。
1.1.3 仪器设备 752型紫外-可见分光光度计，SPX-250B-Z型生化培养箱，YXQ-LS-50S型立式压力蒸汽灭菌器，SHZ型水浴恒温振荡器。
1.2 试验方法
1.2.1 粗酶液的制备 将黄孢原毛平革菌接种在固体PDA培养基上，置于30 ℃恒温培养箱中培养。待菌种长满整个平板后取8 mm菌塞， 取液体培养基100 mL，装入250 mL三角瓶中，接入菌塞2个， 30 ℃、120 r/min恒温振荡培养。 选取黄孢原毛平革菌第8 d的培养液经4 000 r/min、15 min离心后取上清液作为粗酶液。
1.2.2 酶活测定 木质素过氧化物酶（LiP）： 50 mmol/L的酒石酸-酒石酸钠缓冲液（pH约2.5）、 去离子水、 2 mmol/L的蔾芦醇、4 mmol/L H2O2以及一定量的粗酶液，用紫外-可见分光光度计检测310 nm处在2.5 min内吸光度变化。将1 μmol/min蔾芦醇氧化成蔾芦醛所需的酶量为1个酶活力单位。
锰过氧化物酶（MnP）：50 mmol/L的酒石酸-酒石酸钠缓冲液（pH约5.0）、 1.6 mmol/L H2O2、6 mmol/L MnSO4以及一定量的粗酶液，用紫外-可见分光光度计检测310 nm处在4 min内吸光度变化，将1 μmol/min Mn2+氧化为Mn3+所需的酶量为1个酶活力单位。
木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的性质测定方面，分别选择Na+、 K+、 Mg2+、Ca2+、 Fe3+、 Fe2+、 Zn2+、 Cu2+、 Ag+等金属离子，阴离子NO3-、 Cl-、 Br-以及乙二胺四乙酸（EDTA）、 抗坏血酸作为效应物。在酶活力测试体系中， 加入不同浓度的效应物， 测定酶的相对活力。
2 结果与分析
2.1 不同金属离子对酶活力的影响
向反应体系中加入浓度为50 mmol/L金属离子溶液，使反应体系金属离子终浓度为5 mmol/L，预热至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL启动反应，测定反应最初3 min内λ=240 nm处吸光度变化。其余金属离子在相同温度、pH条件下测定酶活力[12]，结果如图1、图2所示。
由图1可知，随着Ca2+浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力增加，这说明Ca2+对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活有一定促进作用。而随着Na+浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力减小，这说明Na+对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。而随着K+和Mg2+浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力变化不明显。Zn2+只有在浓度达到24 mmol/L才表现出明显的促进作用，随之到达28 mmol/L，又迅速降到原来水平。而随着Fe2+浓度从4 mmol/L增加到24 mmol/L，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力由慢而快地增大，超过12 mmol/L，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力又由快到慢地降到原来水平，这说明Fe2+浓度为12 mmol/L时，酶活力最高。Fe3+则是随着浓度的增加，到28 mmol/L时，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力近乎降到0，这说明Fe3+对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力有一定抑制作用。在4～8 mmol/L时，随着Cu2+浓度的增加，酶活力也增加；当Cu2+浓度为8 mmol/L时，酶活力最高；8 mmol/L之后，酶活力随着Cu2+浓度的增加而降低。而Ag+浓度几乎不影响木质素过氧化物酶（LiP）的酶活性。
由图2可知，在同样条件下，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力也随金属离子浓度改变而改变。随着Ca2+浓度的增加，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力逐渐增加，这说明Ca2+对锰过氧化物酶（MnP）的酶活力也有一定促进作用。而随着Na+浓度的增加，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力减小，这说明Na+对锰过氧化物酶（MnP）的酶活力也有一定抑制作用。而随着K+和Mg2+浓度的增加，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力也变化不明显。Zn2+只有在浓度达到24 mmol/L才表现出明显的促进作用，到达28 mmol/L后又迅速降到原来水平，这点与对木质素过氧化物酶（LiP）的作用类似。但是，较对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力影响有所不同的是，Fe2+始终对锰过氧化物酶的酶活力起促进作用，而且锰过氧化物酶（MnP）的酶活力与浓度成正比。Fe3+对锰过氧化物酶（MnP）的酶活力也有一定抑制作用，而且锰过氧化物酶（MnP）的酶活力与Fe3+浓度成反比。在4～8 mmol/L时，随着Cu2+浓度的增加，酶活力也增加，当Cu2+浓度为8 mmol/L时，酶活力最高；8 mmol/L之后，酶活力随着Cu2+浓度的增加而降低，这与对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力影响比较分析，其结果近乎类似。而Ag+浓度也几乎不影响锰过氧化物酶（MnP）的酶活力。
2.2 不同阴离子对酶活力的影响
向反应体系中加入浓度为50 mmol/L阴离子表面活性剂，使反应体系阴离子终浓度为5 mmol/L，预热至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL启动反应，测定反应最初3 min内λ=240 nm处吸光度变化。其余阴离子在相同温度、pH条件下测定酶活力[12]，结果如图3所示。
由图3可知，阴离子表面活性剂对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力有明显的影响。在15～30 mmol/L时，随着Br-和Cl-浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力升高，这说明Br-和Cl-对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力有一定促进作用。在30～105 mmol/L时，随着Br-和Cl-浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力降低，酶活力与浓度关系成反比，这说明Br-和Cl-对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力有一定抑制作用。结果表明，当30 mmol/L时，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力达到最大，但是对其作用方向是激活或是抑制没有统一的结果，只是Br-比Cl-的激活作用稍弱。而随着NO3-浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力变化不明显。
2.3 不同有机小分子对酶活力的影响
2.3.1 乙二胺四乙酸对酶活力的影响 在富氮和限氮培养基中分别添加0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的乙二胺四乙酸（EDTA），37 ℃培养7 d后分别测定出发菌株和诱变菌株的酶活力，预热至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL启动反应，测定反应最初3 min内λ=240 nm处吸光度变化，结果如图4所示。
由图4可知，在限氮条件下，出发菌株和诱变菌株的酶活力随着乙二胺四乙酸（EDTA）的浓度改变而异，添加乙二胺四乙酸（EDTA）后，酶活力有较大幅度上升。从0～0.6 g/L，乙二胺四乙酸（EDTA）和酶活力呈正比，之后随着浓度的增加，酶活力呈下降趋势，峰值酶活力对映的乙二胺四乙酸（EDTA）浓度为0.6 g/L。而在富氮条件下，对于出发菌株和诱变菌株，乙二胺四乙酸（EDTA）浓度为0.6 g/L时，能较大幅度提高酶活力，添加其他浓度的乙二胺四乙酸（EDTA）时，则对酶活力影响不大。
在添加乙二胺四乙酸（EDTA）的条件下，限氮培养比富氮培养更能提高出发菌株和诱变菌株的酶活力。结果表明，乙二胺四乙酸（EDTA）能去除酶中重金属杂质，从而解除重金属离子对木质素过氧化物酶（LiP）的抑制作用。
2.3.2 抗坏血酸对酶活力的影响 在富氮和限氮培养基中分别添加0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的抗坏血酸，37 ℃培养7 d后分别测定出发菌株和诱变菌株的酶活力，预热至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL启动反应，测定反应最初3 min内λ=240 nm处吸光度变化，结果如图5所示。
由图5可知，在限氮条件下，出发菌株和诱变菌株的酶活随着抗坏血酸的浓度改变而改变。在添加0.05～0.1 g/L的抗坏血酸后，酶活力上升，当浓度大于0.1 g/L后，酶活力与浓度呈反比。而富氮条件下，对于出发菌株和诱变菌株，添加0.05～0.4 g/L的抗坏血酸后，酶活力上升，浓度为0.4 g/L时，酶活力最高。之后随着浓度的增加，酶活力降低。
在添加抗坏血酸的条件下，限氮培养比富氮培养更能提高出发菌株和诱变菌株的酶活力。
3 结论
1）经过木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的酶学性质对比分析，表明Fe3+对木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）都有很强的抑制作用，Fe2+、Ca2+则对木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）表现出不同的促进作用。此外，Na+对木质素过氧化物酶（LiP）表现出一定的抑制作用，对锰过氧化物酶（MnP）作用却不明显，Cu2+对锰过氧化物酶（MnP）有很强的促进作用，但对木质素过氧化物酶（LiP）作用不明显。
2）在阴离子影响酶活力方面，Br-比Cl-的激活作用稍弱。这与具体的反应机理有关，缺乏对照的试验将很难给出客观的数据分析。
3）在添加乙二胺四乙酸（EDTA）或抗坏血酸的条件下，限氮培养比富氮培养更能提高出发菌株和诱变菌株的酶活力。
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