摘要 [目的] 测定海洋放线菌S.areniocola CNS-205腺苷化结构域基因sare0357的酶活。[方法] 选取海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS A domain基因sare0357，对其进行克隆表达和功能鉴定。[结果] 在以Trp为底物时测定Sare0357蛋白的酶动力学参数为：Km=（0.040 33±0.003 67）mmol/L，Vmax =（2.135 05±0.029 43）μmol/（min·L），kcat =（14.233 6±0.196 2）min;Phe为底物时：Km=（0.027 65±0.001 51）mmol/L，Vmax =（1.558 06±0.009 7）μmol/（min·L），kcat=（10.387 1 ±0.064 6）min。[结论]丰富洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS腺苷化结构域的底物特异性和密码子领域的研究，为组合生物学和体外酶系合成NRPs提供依据。
关键词 海洋放线菌;非核糖体多肽合成酶;腺苷化结构域;底物特异性;sare0357
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11632-04
Determination of Enzyme Activity of sare0357， a Gene of Adenylation Domain from Marine Actinomycete S.arenicola CNS-205
LU Sheng-li1， QI Chao2*
（1. Medical department， Anqing Medical College， Anqing， Anhui 246052;
2. Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology， College of Life Sciences，Huazhong Normal University， Wuhan，Hubei 430079）
Abstract [Objective] The aim was to determine enzyme activity of sare0357， a gene of adenylation domain from marine actinomycete S.arenicola CNS-205. [Method] Marine actinomycetes Salinispora arenicola CNS - 205 NRPS A domain gene sare0357 was selected， and the cloning expression and function identification were done. [Result] It was found that Sare0357 could recognize specifically and activate tryptophan （Try） and phenylalanine （Phe）. The basic kinetic parameters of it for these two substrates were detected as Km = （0.040 33±0.003 67） and （0.027 65 ±0.001 51）mmol/L， Vmax = （2.135 05±0.029 43） and （1.558 06 ±0.009 7）μmol/min and kcat =（14.233 6±0.196 2） and （10.387 1 ±0.064 6） min for Try and Phe respectively. [Conclusion] The aim riched ocean actinomycetes Salinispora arenicola CNS-205 NRPS of adenosine structure domain research in the field of the substrate specificity and codes， and provided the basis for combination of biology and enzyme system in vitro synthetic NRPS .
Key words Marine actinomycete; Noibosomal peptide synthetases;Adenylation domain
基金项目 国家自然科学基金项目（20772040）;教育部中央高校自主项目（CCNU14F01006）。
作者简介 陆胜利（1966-），男，安徽安庆人，讲师，从事无机与分析化学研究。*通讯作者。
收稿日期 2014-10-15
海洋放线菌能通过非核糖体多肽合成酶（NRPSs）合成一系列的具有药用价值的生物活性物质——非核糖体多肽（NRPs）。非核糖体多肽合成酶（NRPSs）由一系列的模块构成，其中的氨基酸腺苷化结构域（A domain）能特异性识别和激活氨基酸底物，在非核糖体多肽合成中起着关键性作用。
海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205基因组测序结果表明， 在5 786 361 bp 的环状染色体中分布有10个NPRS相关基因簇，sare0357基因属于10个基因簇中的SA ps1 （sare0345-0367）[1-2]。sare0357基因在NCBI上被假定为NRPS腺苷化结构域基因。笔者选取海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS A domain基因sare0357，对其进行克隆表达和功能鉴定，能丰富洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS腺苷化结构域的底物特异性和密码子领域的研究，同时也可为组合生物学和体外酶系合成NRPs提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1
菌株、质粒。
稀有海洋放线菌Salinispora arenlocola CNS205试验菌株为华中师范大学结构生物学实验室保存。
表达载体（pET28-a、pGEX-KG）、表达质粒和感受态细菌（E.coli DH5α、E.coli BL21）为安庆医药高等专科学院实验室保存。
1.1.2
主要试验仪器。凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司;高速冷冻离心机，核酸蛋白质分析仪，均为德国Eppendorf公司;荧光多功能酶标仪，美国Bio-Tek公司。
1.1.3
蛋白的表达和纯化。 蛋白的表达和纯化见文献[3]。
1.2 Sare0357复性蛋白的酶活测定
采用2009年Thomas J. McQuade等报道的孔雀石绿钼酸铵化学显色定磷法检测Sare0357梯度浓度透析复性的成功与否并同时测定Sare复性蛋白的酶活。
1.2.1
Sare0357复兴蛋白底物特异性筛选。选取20种常见氨基酸为底物，于96孔板中进行Sare0357复兴蛋白底物特异性筛选，反应体系为100 μl（表1），设定没有加入Sare0357复性蛋白的反应体系为对照组，通过比较不同氨基酸体系下Sare0357复性蛋白的相对活性，得出Sare0357复性蛋白的底物特异性。
表1 100 μl的反应体系组分
反应体系的加入顺序依次为氨基酸、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、Sare0357复性蛋白、无机焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP时反应开始，25 ℃孵育5 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，反应产物在620 nm处有最大吸光值，通过酶标仪检测其620 nm处的吸光值。
1.2.2
基本酶动力学参数的测定。（1） PPi标准曲线的测定。以PPi为底物，于96孔板中进行PPi标准曲线的测定（表2 ），反应体系为100 μl。
表2 PPi标准曲线的测定
反应体系的加入顺序依次为PPi、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、无机焦磷酸酶。最后加入无机焦磷酸酶时反应开始，25 ℃孵育2 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，反应产物在620 nm处有最大吸光值，通过酶标仪检测其620 nm处的吸光值。
以PPi浓度为横轴，酶标仪测得的620 nm处的吸光值为纵轴，即可绘制出PPi标准曲线。
（2）ATP自水解曲线的测定。于96孔板中进行ATP自水解曲线的测定（表3），反应体系为100 μl。
表3 ATP自水解曲线的测定
反应体系的加入顺序依次为氨基酸、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、无机焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP时反应开始，25 ℃分别孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，反应产物在620 nm处有最大吸光值，通过酶标仪检测其620 nm处的吸光值。
以反应体系孵育时间为横轴，酶标仪测得的620 nm处的吸光值为纵轴，即可绘制出ATP自水解曲线。
（3）酶促反应初速度范围的测定。分别以苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）为底物，于96孔板中进行酶促反应初速度范围的测定（表4），反应体系为100 μl。
反应体系的加入顺序依次为Phe/Trp、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、不同浓度的Sare0357复性蛋白、无机焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP时反应开始，25 ℃分别孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，反应产物在620 nm处有最大吸光值，通过酶标仪检测其620 nm处的吸光值。
表4 酶促反应初速度范围的测定
对反应体系孵育时间和PPi的生成量作非线性回归分析，绘制时间-进程曲线，线性范围内，生成PPi量最大的酶浓度即为酶的最佳反应浓度。
对反应体系中酶浓度和PPi的生成速率作非线性回归分析，绘制酶浓度-PPi生成速率曲线，线性范围内，最大PPi生成速率的孵育时间即为最适孵育时间。
（4）目的蛋白基本酶动力学参数的确定。
在（3）酶促反应初速度范围测定得到的酶促反应的最适酶浓度和最佳孵育时间条件下，分别以Phe、Trp为底物，于96孔板中进行目的蛋白基本酶动力学参数的测定（表5 ），反应体系为100 μl。
表5 目的蛋白基本酶动力学参数的确定
反应体系的加入顺序依次为不同浓度的Phe/Trp、甘油、Tris-HCl （pH 7.5）、DTT、MgCl2、Sare0357复性蛋白、无机焦磷酸酶、ATP。最后加入ATP时反应开始，25 ℃分别孵育2 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，反应产物在620 nm处有最大吸光值，通过酶标仪检测其620 nm处的吸光值。
以反应体系Phe/Trp浓度为横轴，生成PPi的速率为纵轴，通过非线性回归分析，拟合米氏方程曲线并求得酶动力学参数（Km、Vmax、kcat）。
2 结果与分析
采用Thomas J. McQuade等新建的一种孔雀石绿钼酸铵化学显色定磷法进行高通量筛选和测定A结构域的酶活[4]。此法综合了酶偶联法（偶联无机焦磷酸酶）、化学显色法及光吸收法，能够快速准确地对Sare0357复性蛋白进行酶活测定。
通过高通量筛选的孔雀石绿钼酸铵化学显色定磷法，Sare0357复性蛋白对20种常见氨基酸的活性见图1。相较于其他18种氨基酸，以Phe/Trp为底物时，Sare0357复性蛋白酶促反应的显色结果较为明显，其中，又以Trp为底物时，Sare0357复性蛋白酶促反应的显色结果最深，呈黄绿色。
通过酶标仪可测得以20种常见氨基酸为底物时，孔雀石绿钼酸铵化学显色定磷法显色后反应产物在620 nm处的吸光值，由此可得到Sare0357复性蛋白对20种常见氨基酸的相对活性的比较。图2与图1所示结果相符，相较于其他18种氨基酸，以Phe/Trp为底物时，显色后反应产物在620 nm处的吸光值较大，Sare0357复性蛋白的相对活性较高;其中，又以Trp为底物时，显色后反应产物在620 nm处的吸光值最大，Sare0357复性蛋白的相对活性最高。由此可得，20种常见氨基酸中，Phe/Trp为Sare0357复性蛋白特异性识别底物。其中Sare0357复性蛋白识别Trp的底物特异性大于Sare0357复性蛋白识别Phe的底物特异性。
注：Control：不含Sare0357变性蛋白的阴性对照组（含Trp）Trp、Phe;1～9. Gly、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met、Gin;10～18. Asp、Glu、Arg、Lys、His、Pro、Asn、Tyr、Ala。
图1 孔雀石绿钼酸铵化学显色定磷法筛选Sare0357复性蛋白的底物特异性
注：将Sare0357复性蛋白对Trp的活性值记作100%。
图2 Sare0357复性蛋白对20种常见氨基酸的相对活性
以PPi为底物，于96孔板中进行PPi标准曲线的测定，以未添加氨基酸、Sare0357复性蛋白以及ATP的反应体系测定PPi标准曲线。25 ℃孵育2 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，通过酶标仪检测反应产物在620 nm处的吸光值。以PPi浓度为横轴，酶标仪测得的620 nm处的吸光值为纵轴，即可绘制出PPi标准曲线，结果见图3。
图3 PPi标准曲线
于96孔板中进行ATP自水解曲线的测定，以未添加Sare0357复性蛋白的反应体系测ATP自水解曲线。25 ℃分别孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，通过酶标仪检测反应产物在620 nm处的吸光值。以反应体系孵育时间为横轴，酶标仪测得620 nm处的吸光值为纵轴，即可绘制出ATP自水解曲线，结果见图4。
图4 ATP自水解曲线
分别以苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）为底物，于96孔板中进行酶促反应初速度范围的测定，向100 μl的反应体系中依次加入Phe/Trp（0.5 mmol/L）、10%甘油（V/V）、50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、DTT（1 mmol/L）、MgCl2（10 mmol/L）、不同浓度的Sare0357复性蛋白（0.100、0.125、0.150、0.200、0.250、0.300 μmol/L）、无机焦磷酸酶（0.4 U/ml）、ATP（0.5 mmol/L）。25 ℃分别孵育2、4、6、8 min后加入孔雀石绿钼酸铵显色剂100 μl使反应终止。反应终止后将96孔板置于30 ℃下10 min进行显色反应，反应产物在620 nm处有最大吸光值，通过酶标仪检测其620 nm处的吸光值。
对孵育时间和PPi的生成量作非线性回归分析，绘制时间-进程曲线，结果见图5。由图5 A可知，以Trp为底物，
仅当Sare0357复性蛋白≤0.15 μmol/L时，生成PPi的量与孵育时间呈线性递增关系，且在Sare0357复性蛋白浓度为0.15 μmol/L时达到最大反应产物生成速率，由此可知，Trp为底物时，酶促反应的最适酶浓度，即反应体系中Sare0357复性蛋白最适浓度为0.15 μmol/L。同时根据图5 C可知，以Phe为底物，仅当Sare0357复性蛋白≤0.15 μmol/L时，生成PPi的量与孵育时间呈线性递增关系，且在Sare0357
复性蛋白浓度为0.15 μmol/L时达到最大反应产物生成速率，由此可知，以Phe为底物时，酶促反应的最适酶浓度，即反应体系中Sare0357复性蛋白最适浓度为0.15 μmol/L。
对 Sare0357复性蛋白浓度和PPi的生成速率作非线性回归分析，绘制酶浓度-生成速率曲线，结果见图5。由图5B可知，Trp为底物时，只有将孵育时间控制在2 min以内，PPi产物生成速率与酶浓度才能保持线性递增关系，且孵育2 min可达到最大产物生成速率。所以，Trp为底物时，酶促反应的最佳孵育时间为2 min。由图5D可知，Phe为底物时，只有将孵育时间控制在2 min以内，不同酶浓度下的PPi产物生成速率与酶浓度才能保持线性递增关系，且孵育2 min可达到最大产物生成速率。所以，Phe为底物时，酶促反应的最佳孵育时间为2 min。
综上可知，无论是Trp还是Phe为底物，酶促反应的最
注：A、 C. 时间进程曲线，以PPi生成量对孵育时间作线性拟合（A为Trp底物下的时间进程曲线，C为Phe底物下的时间进程曲线）。B、 D. 酶浓度曲线，以PPi生成速率对Sare0357复性蛋白浓度作线性拟合（B为Trp底物下的时间进程曲线，D为Phe底物下的酶浓度曲线）。
图5 最佳孵育时间和最适酶浓度的确定
适酶浓度为0.15 μmol/L，最佳孵育时间为2 min。
在酶促反应最适酶浓度和最佳孵育时间条件下，分别以Phe、Trp为底物，测定不同丙氨酸浓度进行酶促反应时PPi 的生成速率。
以反应体系Phe/Trp浓度为横轴，生成PPi的速率为纵轴，通过非线性回归分析，拟合米氏方程曲线（图6），并求得酶动力学参数（Km、Vmax、kcat）。Sare0357复性蛋白对Trp的酶动力学参数为：Km=（0.040 33±0.003 67）mmol/L，Vmax=（2.135 05±0.029 43）μmol/（L·min），Kcat=（14.233 6±0.196 2）min;Sare0357复性蛋白对Phe的酶动力学参数为：Km= （0.027 65 ±0.001 51）mmol/L，Vmax=（1.558 06±0.009 7）μmol/（L·min），Kcat=（10.387 1 ±0.064 6）min。
注：A.Trp为底物时，Sare0357复性蛋白酶动力学参数的测定;B.Phe为底物时，Sare0357复性蛋白酶动力学参数的测定。
图6 Sare0357复性蛋白酶动力学参数的测定
3 讨论
该研究对Sare0357复性蛋白酶活测定结果显示Sare0357复性蛋白具有Trp和Phe底物特异性，能识别并活化Trp和Phe参与NRP的合成，是Trp和Phe特异性的NRPS腺苷化结构域蛋白。而生物信息学预测结果显示，Sare0357蛋白氨基酸序列标签为DARSVSQMTK，无相应预测底物，与试验结果不符。实际上，基于一直以来对A domain的大量研究工作，尽管利用生物信息学可以较准确地进行A domain底物特异性的预测，但纵观近年海洋放线菌NRPS腺苷化结构域底物特异性研究，不难发现A结构域预测底物与实际徼活氨基酸底物并不匹配的报道。如SCHULTZ等[2]对cymA（S.arenicola CNS-205 Cyclomarin生物合成基因簇基因）采取生物信息学手段进行底物特异性分析，预测结果表明cymA的7个腺苷化结构域中有6个无匹配底物，而试验结果表明这6个预测结果表明没有匹配底物的腺苷化结构域基因表达产物均有相对应的特异性底物识别[2]。
实际上，现有的MALDONADO等[5]、STACHELHAUS等[6]建立的A domain底物特异性密码子数据库的试验数据几乎全部来源于陆生菌属。而海、陆两地放线菌在生理学和种系发育上显著差异可能造成了海洋放线菌A domain底物特异性预测的不准确性。由此可见，海洋放线菌作为一个全新的系统，需要建立其独特的A domain底物特异性“密码子”数据库。目前对于海洋放线菌NRPS腺苷化结构域的研究积累还不够，需要大量的试验数据来建立海洋放线菌NRPS A doamin底物特异性密码子数据库，并在此数据库基础上开发、建立更为准确可靠的海洋放线菌NRPS A doamin底物特异性生物信息学预测方法。
参考文献
[1]PENN K，JENKINS C，NETT M，et al.Genomic islands link secondary metabolism to functional adaptation in marine Actinobacteria[J].ISME J，2009，3（10）：1193-1203.
[2] SCHULTZ A W，OH D C，CARNEY J R，et al.Biosynthesis and structures of cyclomarins and cyclomarazines，prenylated cyclic peptides of marine actinobacterial origin[J].J Am Chem Soc，2008，130（13）：4507-4516.
[3] 陆胜利，祁超.海洋放线菌对S.areniocola CNS-205腺苷化结构域基因的克隆、表达和纯化[J].华中师范大学学报：自然科学版，已接受。
[4] MCQUADE T J，SHALLOP A D，SHEORAN A，et al.A noadioactive high-throughput assay for screening and characterization of adenylation domains for noibosomal peptide combinatorial biosynthesis[J].Anal Biochem，2009，386（2）：244-250.
[5] MALDONADO L A，FENICAL W，JENSEN P R，et al.Salinispora arenicola gen.nov.，sp.nov.and Salinispora tropica sp.nov.，obligate marine actinomycetes belonging to the family Micromonosporaceae[J].Int J Syst Evol Microbiol，2005，55（5）：1759-1766.
[6] STACHELHAUS T，MOOTZ H D，MARAHIEL M A.The specificity-conferring code of adenylation domains in noibosomal peptide synthetases[J].Chem Biol，1999，6（8）：493-505.