对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111865-201403，纯度：94.7%）;龙胆苦苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110770-201716，纯度：97.6%）;芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110736-200630，纯度100%）;5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1523-200001，纯度：93.8%）。
蒿秦化斑颗粒（每1 g含生药3.113 g，规格：12 g/袋，批号：170424，170425，170426），属于首都医科大学北京中医医院院内制剂。乙腈（Fisher Chemical，色谱纯）、磷酸为优级纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Kinetex EVO C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长235 nm，柱温35℃，进样量为10 μL。
2.2 混合对照品溶液制备
精密称取马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含马钱苷酸34.76 μg、含龙胆苦150.30 μg、含芍药苷172.16 μg、含5-O-甲基维斯阿米醇苷5.50 μg混合对照品溶液，即得。
2.3 供试品溶液制备
取蒿秦化斑颗粒，研细，精密称定0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率180 W，频率60 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液制备
按处方中药味的比例及制法分别制备不含秦艽（马钱苷酸、龙胆苦苷）、防风（5-O-甲基维斯阿米醇苷）、赤芍和牡丹皮（芍药苷）的阴性样品，再按照“2.3”项下方法制备相应的阴性对照溶液。
2.5 专属性考察
分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL注入液相色谱仪，结果表明阴性对照不干扰对应成分的测定且其分离度均大于1.5，表明此方法的专属性较强。见图1。
2.6 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量为横坐标，以峰面积值为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算回归方程及线性范围。见表2。
2.7 精密度試验
精密吸取同一标准品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，分别记录马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷四种成分的峰面积，其RSD分别为0.80%、0.36%、0.53%、1.32%，提示仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、16 h按“2.1”项下色谱条件测定，计算马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD分别为0.52%、0.88%、0.86%、1.92%，提示供试品溶液在16 h内基本稳定。
2.9 重复性试验
取同一批样品6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，结果马钱苷酸平均含量为0.1697%，RSD为0.18%;龙胆苦苷平均含量为0.6995%，RSD为0.70%;芍药苷平均含量为0.7582%，RSD为0.49%、5-O-甲基维斯阿米醇苷平均含量为0.0226%，RSD为1.96%，提示该方法重复性良好。
2.10 加样回收率试验
取已知含量的蒿秦化斑颗粒样品9份，每份0.15 g，精密称定，分别按已知含量的50%、100%、150% 3个水平加入对照品，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件下测定，计算加样回收率。马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均加样回收率分别为97.85%、98.30%、94.66%、96.08%，RSD分别为1.00%、0.69%、1.72%、1.90%，提示该方法的准确性良好。见表3。
2.11 含量测定
取3批蒿秦化斑颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下测定马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。见表4。
2.12 高效液相色谱法的耐用性考察
在耐用性考察范围内，色谱条件中检测波长、流动相酸度、流速微小变化时，含量测定结果差异无统计学意义（P > 0.05），而柱温改变对含量测定结果影响较大，应在实验中予以关注并严格控制。见表5。
3 讨论
3.1 色谱条件选择
试验中对液相条件的选择参照文献[18-21]，为选择合适的检测波长，分别对各对照品进行光谱扫描，结果发现，马钱苷酸在235 nm有最大吸收，龙胆苦苷在246 nm有最大吸收，芍药苷在231 nm附近有最大吸收，5-O-甲基维斯阿米醇苷在213、231、295 nm处有最大吸收。为提高检测灵敏度，减少供试品中其他成分对色谱峰的干扰，最终选择235 nm为检测波长，4种成分均有较好吸收，且结果稳定。对不同的流动相系统如乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液等进行比较，结果发现当用乙腈-水为流动相时，待测组分峰形较差，以乙腈-0.1%乙酸溶液为流动相时，对基线干扰较大，而甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相分析时间太长。因此，选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，按“2.1”项下的洗脱程序进行分析，各成分色谱峰峰形良好，分离度均大于1.5。
3.2 提取时间考察
考察不同提取时间的影响，选用50%甲醇分别超声提取15、30、45、60 min，结果超声提取15、30、45、60 min的样品中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量基本一致。综合考虑，采用超声30 min作为供试品溶液制备的提取时间。
3.3 提取溶剂量考察
分别采用20、25、30 mL 50%甲醇超声提取30 min，考察不同提取溶剂量对提取效果的影响，结果测得样品中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量基本一致，故采用25 mL作为供试品溶液的提取溶剂量。
3.4 小结
近年来，中药制剂的质量控制取得了一定的进展，但也存在不足之处，即单一指标不足以代表处方的整体质量水平。因此，制订多成分、多指标的含量标准，可从多方面控制中药制剂的产品质量，使其疗效可靠、稳定。本研究采用高效液相色谱同时测定蒿秦化斑颗粒中4种指标性成分的含量，为该制剂综合质量的评价提供准确、快捷的定量分析方法，进一步提高了质量控制标准[22-25]。
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（收稿日期：2018-12-03 本文编辑：王 蕾）