[摘要] 目的 檢测CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17 细胞在胃癌患者外周血中的表达，探讨两种细胞在胃癌中的临床意义。 方法 随机选取我院收治的胃癌患者30例，作为胃癌组，另选取同期在我院进行健康体检人员30例作为正常组，对两组外周血中CD4、CD25、Foxp3、IL-17的表达进行检测，分析CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17 细胞的数量和比例。 结果 胃癌组外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17 细胞的表达均高于正常组（P<0.05）；胃癌组中晚期、T3+T4、有淋巴结转移患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达分别高于早期、T1+T2、无淋巴结转移患者（P<0.05），但不同肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移患者之间Th17细胞的表达差异均不显著（P>0.05）。 结论 胃癌患者外周血中CD4+CD25调节性T细胞和 Th17 细胞的表达均显著升高，且提示肿瘤进展和CD4+CD25+调节性T细胞相关，但与Th17 细胞无明显统计学相关。
[关键词] 胃癌；外周血；CD4+CD25+调节性T细胞；Th17细胞
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）13-0021-04
The expression and clinical significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of patients with gastric carcinoma
LIN Xiuqing HUANG Zhiming CHEN Xin WU Fang XUE Haibo CHEN Chao
Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Objective To assess the expression and discuss the clinical significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of patients with gastric carcinoma. Methods 30 patients with gastric carcinoma in our hospital were randomly selected as the gastric carcinoma group. 30 people who checked up their health condition in our hospital during the same period were selected as the normal group. The expression of CD4， CD25， Foxp3 and IL-17 in peripheral blood was assessed in both groups. The amount and proportion of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells were analyzed. Results The expression of CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in gastric carcinoma group increased compared with that in normal group（P<0.05）. The expression of CD4+CD25+ regulatory T cells in peripheral blood of patients with advanced gastric carcinoma， gastric carcinoma in T3+T4 and gastric carcinoma with lymph node metastasis was higher than that in patients with early gastric carcinoma， gastric carcinoma in T1+T2 and gastric carcinoma without lymph node metastasis respectively（P<0.05）. No significant difference was noticed in the expression of Th17 cells in patients with gastric carcinoma in different stages， depth of infiltration or with lymph node metastasis（P>0.05）. Conclusion The expression of both CD4+CD25+ regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of patients with gastric carcinoma increased significantly. It was also suggested the progression of gastric carcinoma was associated with CD4+CD25+ regulatory T cells， but not associated with Th17 cells statistically.
[Key words] Gastric carcinoma；Peripheral blood；CD4+CD25+ regulatory T cells；Th17 cells
胃癌是常见恶性肿瘤之一，我国是胃癌多发国家。但目前以手术为主的综合治疗方法疗效不理想，且进展期胃癌大多失去手术机会，故近年来免疫治疗越来越受到重视。很多相关研究均表明[1-3]，肿瘤宿主的免疫状态对其发生发展会产生直接而深刻的影响。T细胞亚群及其功能特征研究一直是免疫学的研究热点，CD4+辅助性T细胞可分为调节性T细胞、Th1、Th2、Th17细胞四种类型[4]。近年来，很多研究报道了Treg及Th17，证实Th17/Treg细胞失衡现象不仅存在于自身免疫性疾病中，还存在于移植物抗宿主病及炎症性肠病中等疾病[5-7]，但是目前有关其在肿瘤发生中作用的相关报道不多。故本研究通过检测胃癌患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17 细胞的表达，探讨CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17 细胞的临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取2014年6月～2016年6月我院收治的胃癌患者30例作为胃癌组，纳入标准：所有患者均经手术病理或胃镜活检证实为胃癌；排除标准：有心肝肾等重要脏器疾病、有肿瘤家族史等患者。其中男22例，女8例，年龄24～84岁，平均（62.3±10.4）岁。在肿瘤分期方面，6例为早期胃癌（ⅠA期、ⅠB期），24例为中晚期胃癌（ⅡA期、ⅡB期、ⅢA期、ⅢB期、Ⅳ期）。另选取同期在我院进行健康体检的人员30例作为正常组，其中男20例，女10例，年龄25～84岁，平均（63.9±10.2）岁。两组一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 淋巴細胞提取 清晨抽取两组人员的3 mL空腹静脉血，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，然后将外周血中PBMC分离出来，在此过程中将淋巴细胞分离液（Ficoll液）充分利用起来。
1.2.2 CD4+CD25+调节性T细胞检测 配置1×106个/100 μL细胞悬液，标记检测新鲜分离的单个核细胞，将5 μL膜抗体异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）anti-human CD4、5 μl APC anti-human CD25加入试管中，设相应的同型对照，在4℃的温度下进行30 min的避光孵育，然后用PBS进行洗涤，将上清弃去后，将1 mL固定破膜剂加入其中，混匀，在常温下进行45 min的避光孵育，然后将2 mL破膜缓冲剂加入其中，离心将上清弃去，将5 μl抗体PE anti-human Foxp 3加入其中，混匀，在4℃的温度下进行45 min的避光孵育，然后将2 mL破膜缓冲剂加入其中，离心将上清弃去，将300 μL PBS加入到各管，充分混匀后用流式细胞仪检测。
1.2.3 Th17细胞检测 配置1×106个/100 μL细胞悬液，标记检测新鲜分离的单个核细胞，将0.5 μL 1 μmg/mL PMA+0.5 μL 1 μg/mL Ionomycin加入其中，在37℃的培养箱中放置，进行1 h的刺激，将2 μL BFA加入其中，在37℃的培养箱中放置，进行3 h的刺激，然后对上清进行洗涤，将30 μL FITC anti-human CD4抗体加入试管中，设相应的同型对照。在4℃的温度下进行15 min的避光孵育，然后进行洗涤，将100 μL破膜剂加入其中，离心将上清弃去，将5 μL PE anti-human IL-17抗体加入其中，混匀，在4℃的温度下进行30 min的避光孵育，进行洗涤，将上清弃去后再将300 μL PBS加入其中，充分混匀后用流式细胞仪进行检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS21.0统计学软件，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组一般资料比较
两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 两组患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17 细胞的表达比较
胃癌组外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17细胞的表达均高于正常组（P<0.05）。见表2。
2.3 胃癌组患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17 细胞的表达比较
胃癌组中晚期、T3+T4、有淋巴结转移患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达分别高于早期、T1+T2、无淋巴结转移患者（P<0.05），但不同肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移患者之间Th17 细胞的表达差异均不显著（P>0.05）。见表3。
3讨论
肿瘤对人类健康造成了严重威胁，在我国，恶性肿瘤患者达到了160万人/年，在人类死亡病因中居首位[8]。因此，早期诊断和治疗肿瘤成为临床研究的重点，而现阶段，在肿瘤的治疗中，继手术、放化疗后，免疫治疗在临床得到了日益广泛的应用，其目的为将机体免疫系统激发调动起来，促进肿瘤微环境抗肿瘤免疫力的增强，对肿瘤细胞进行控制并将其杀伤[9]。胃癌的发生发展是多因素、多基因综合作用的结果，除了环境、感染、遗传因素外，机体免疫系统的功能状态也是重要方面。T 细胞亚群及其功能特征研究一直是免疫学的研究热点，Treg及Th17细胞是两种淋巴细胞群，Treg 细胞主要功能是对机体免疫功能进行负向调节，Th17细胞介导炎症反应，但在不同肿瘤中作用不同，两者关系复杂，现阶段得到了临床的广泛重视[10]。相关医学研究表明[11-13]，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg在多种肿瘤中增加，如胃肠道肿瘤、肺癌等，以此认为肿瘤患者可能有天然免疫反应存在，而其分化及调节过程和Treg及Th17细胞具有极为密切的关系。相关动物实验表明[14-16]，随着肿瘤不断进展，Treg及Th17细胞比例逐渐提升，同时在进展期肿瘤中的表达水平最高。
既往研究表明[17-18]，Th细胞亚群间具有可塑性，在肿瘤坏死因子β（tumor necrosis factor β，TGF-β）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）的作用下，Foxp3+调节性T细胞能够重新编程向Th17样细胞分化，对初始CD4+T细胞进行诱导，向Treg细胞分化，Foxp3+调节性T细胞也能够向Th17细胞分化，提示两种细胞亚群间关系密切。现阶段，相关研究证实[19-20]，Th17表达水平在多种恶性肿瘤患者体内均较高，如前列腺癌、卵巢癌、胃癌等。本研究结果提示，胃癌组外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17细胞的表达均显著高于正常组（P<0.05）；胃癌组中晚期、T3+T4、有淋巴结转移患者外周血中CD4+CD25+調节性T细胞的表达分别显著高于早期、T1+T2、无淋巴结转移患者（P<0.05），与上述研究结果一致，提示CD4+CD25+调节性T细胞和肿瘤进展相关，可能在肿瘤的发生发展中起重要的作用。虽然结果未提示Th17细胞与肿瘤进展存在显著统计学相关，但Th17细胞本身功能和机制复杂，有待进一步深入研究。
综上所述，胃癌患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和 Th17细胞的表达均显著升高，且提示肿瘤进展和CD4+CD25+调节性T细胞相关，但和Th17细胞无明显统计学相关，有助于我们全面地了解患者的免疫系统情况，对于临床的疗效和预后判断具有重要的意义。但是CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞在胃癌中的具体作用机制有待进一步深入的研究。
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（收稿日期：2017-12-01）