摘要：桉树是中国南方地区的重要用材树种，探讨其贮藏氮素循环机制对于提高桉树人工林氮素利用水平具有一定的研究意义。试验以桉树枝叶组织为研究对象，在观察其物候期基础上，采用紫外分光度法测定了桉树叶蛋白质含量及谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶活性的动态变化。结果表明，秋季桉树叶中的可溶性蛋白含量最低，而在次年的春季其含量最高；夏季其含量则处在春季和秋季中间。谷氨酸合成酶活性在秋季为最高，在次年春季为最低。谷氨酰胺合成酶活性在秋季表现为最高，在次年的春季则表现为最低。桉树叶中的可溶性蛋白含量、谷氨酸合成酶活性以及谷氨酰胺合成酶活性与年份和季节密切相关，三者分别呈现出不同的变化趋势。
关键词：桉树；可溶性蛋白；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸合成酶
中图分类号：S792.39 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）10-0073-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.017
Dynamic Changes of Two Kinds of Enzymes and Soluble Protein
of Eucalyptus Leaves in Different Seasons and Years
ZHU Yu-lin，ZHOU Xing-wen，HUANG Li-ling，SU Jian-mu，ZHAO Ying
（College of Biology and Pharmacy of Yulin Normal University，Yulin 537000，Guangxi，China）
Abstract： Eucalyptus is an important economic tree species in southern China. Research on storage metabolism of eucalyptus would increase its nitrogen utilization level， which had certain research significance. Taking the branch and leaf tissue of eucalyptus as research object， the dynamic change of protein content as well as the activity of glutamate synthetase and glutamine synthetase was observed using UV spectrophotometric method based on the phonological phase. The results showed that， in the beginning of autumn， soluble protein content of eucalyptus leaves was at the lowest level； But in the following spring it was the highest. The soluble protein content in summer was between spring and the autumn. Glutamate synthese activity was the highest in autumn and the lowest in spring. The glutamine synthetase activity was the highest in autumn while lowest in spring. The glutamate synthetase activity， soluble protein content， glutamine synthetase activity was closely related to the season and year， the three of which present different changing trends.
Key words： eucalyptus； soluble protein； glutamate synthetase； glutamine synthetase
氮是植物生長和发育必需的大量矿质营养元素，其在植物体内的转移和再利用方面极大地影响了植物的生产力和质量。谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶是与植物氮素代谢相关的关键酶，主要催化谷氨酸转化为谷氨酰胺、参与光呼吸氨、还原氨、循环氨的再同化等代谢过程，对植物的生长和发育至关重要[1，2]。可溶性蛋白是高等植物中所有蛋白质组分中最为活跃的一部分，是高等植物体内氮素的主要存在形式， 对树木生长发育有重要调节作用[3]。桉树为中国南方重要的用材树种，而多数桉树栽培区立地条件相对较差，土壤肥力水平较低，土壤中氮素较缺乏，外施氮肥已成为当前提高桉树产量的关键技术措施。但长期施用化学氮肥会引起土壤养分结构失调、物理性状变差、导致土壤理化性质恶化等严重的生态问题[4]。因此，探讨桉树氮素营养的积累和分配特征，对于指导桉树人工林的氮素养分管理、提高氮素利用效率具有重要的意义。有学者从土壤理化性质方面分析了桉树人工林土壤肥力变化的趋势及其与植物多样性的关系，并取得了一定的研究成果[5，6]，但涉及到林木氮素循环和转化方面的研究不多[7，8]，其中不同时期桉树贮藏氮素的动态变化研究更为鲜见。因此，针对目前对桉树氮代谢相关变化研究较少的实际，试验探讨了不同年份和季节中桉树叶片中可溶性蛋白和谷氨酸合成酶活性以及谷氨酰胺合成酶活性的动态变化，旨在为桉树的氮素营养研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料的采集与处理
参试桉树为玉林师范学院东校区内种植的广林九号桉，采样部位是一年生的桉树叶片，采样时间分为不同的年份和季节，即2015年7月、9月、11月、12月以及2016年2月、3月、4月，每月下旬各采样1次。以上样品采回后立即整理挂上标签，分开封袋，并及时放进超低温冰箱保存，用于各项指标的测定分析。
1.2 方法
1.2.1 可溶性蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝法[9]，称取桉树叶0.5 g，放入预冷的研钵中，加入少许石英砂和5 mL Tris-HCl缓冲液（0.06 mol/L Tris，0.50 mol/L NaCl，pH 7.8）冰浴研磨成匀浆，匀浆倒入10 mL离心管中，在13 000 r/min、4 ℃离心50 min，离心完后弃去离心管下层的沉淀，取上清液倒入洁净试管中保存，测定的过程均要在低温下进行。取上清液2 mL，加10 mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，2 min 后在紫外可见分光光度计的595 nm波长下比色。记录OD值，计算蛋白质含量。
1.2.2 谷氨酸合成酶活性的测定 参考熊丹[10]的测定方法，略有改动。取桉树叶片1 g，剪碎后置于预冷的研钵中，加预冷的Tris-HCl（pH 7.6）4 mL，冰浴研磨，12 000 r/min離心10 min，上清液即为粗酶提取液。按照顺序向比色皿加入0.4 mL 20 mmol/L的L-谷氨酞胺、0.5 mL 20mmol/L的α-酮戊二酸、0.1 mL 10 mmol/L的KCl、0.2 mL 3 mmol/L的NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和0.3 mL酶液，总体积3.0 mL，不足部分用25 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）补足（1.5 mL）。反应启动后，用紫外可见分光光度计于340 nm处每20 s测定1次OD值，连续测定11次，取光密度稳定减小的一段来衡量酶活性。酶活性用氧化的NADH量（以OD340值减少量表示）来计算谷氨酸合成酶的活性
1.2.3 谷氨酰胺合成酶活性的测定 参考金正勋等[11]的测定方法，略有改动。取新鲜叶片1 g，剪碎后置于预冷的研钵中，加预冷的Tris-HCl（pH 8.0）提取缓冲液10 mL，冰浴研磨，12 000 r/min离心10 min，上清液为粗酶提取液。取0.8 mL粗酶液，加入酶反应液1.1 mL（对照管是先加1.8 mL反应终止液，再加酶提取液），在40 ℃下反应30 min后，测试管加入反应终止液1.8 mL，放置10 min后，测定540 nm下的OD值。
1.3 数据处理
试验所得数据应用Microsoft Office Excel 2007程序处理，并用其作图，运用SAS for Windows统计分析软件进行方差分析，用Duncan氏新复极差法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 桉树叶可溶性蛋白含量的季节和年际变化
桉树叶可溶性蛋白含量的季节和年际变化测定情况见图1。由图1可见，桉树叶可溶性蛋白含量的变化总体呈现为高-低-高-低的趋势。从2015年7月到2016年4月，桉树叶中可溶性蛋白含量在14.793～89.782 μg/gFW波动。其中，桉树叶中可溶性蛋白含量在2015年下半年为下降的变化趋势，次年上半年为先升后降的变化趋势。就季节而言，可溶性蛋白含量在初春为最高，随后极显著下降（P<0.01），夏季其含量有所上升，到了秋季又极显著下降（P<0.01），进入冬季，其含量又极显著升高（P<0.01）。
对桉树叶中可溶性蛋白含量的季节和年际变化进行方差分析与多重比较，结果在桉树叶的生长过程中，可溶性蛋白含量的差异达到了极显著水平（F=1 241.60，P<0.000 1）。其中2015年11月的桉树叶可溶性蛋白含量最小，2016年3月的可溶性蛋白含量最大。就季节而言，桉树叶中可溶性蛋白含量在冬末和初春较高，两者之间差异不显著（P>0.05），但与其他季节时段之间存在极显著差异（P<0.01）。
2.2 桉树叶谷氨酸合成酶活性的季节和年际变化
桉树叶谷氨酸合成酶活性的季节和年际变化测定情况见图2。由图2可见，桉树叶中谷氨酸合成酶活性在2015年下半年呈现出先升后降的变化趋势，次年上半年呈现出先降后升的变化趋势。在不同季节的生长发育过程中，其谷氨酸合成酶活性在初春表现最低，到春末极显著升高（P<0.01）。夏季后降低，到了初秋其活性极显著升高（P<0.01），秋冬季节交替时，其活性为逐渐降低的变化趋势。
2.3 桉树叶谷氨酰胺合成酶活性的季节和年际变化
桉树叶谷氨酰胺合成酶活性的动态变化反映了桉树在不同时期生长过程体内氮素利用的活跃程度，是有机物代谢及植物生长的重要生理基础。桉树叶谷氨酰胺合成酶活性的季节和年际变化测定情况见图3。由图3可见，2015年下半年桉树叶中谷氨酰胺合成酶活性呈现先升后降再升的变化趋势，2016年上半年为逐渐降低的变化趋势。不同季节的谷氨酰胺合成酶活性变化趋势也不同，春季逐渐降低，到春末其活性最低；夏季活性极显著升高（P<0.01）；到了初秋其活性最高，随后极显著降低（P<0.01），进入冬天后又开始升高，冬末下降。
对桉树叶中谷氨酰胺合成酶活性的季节和年际变化进行方差分析与多重比较，结果在桉树叶生长过程中，谷氨酰胺合成酶活性的差异达到极显著水平（F=16.38，P<0.000 1）。桉树叶片的谷氨酰胺合成酶活性在2015年9月是最高的，2016年4月桉树叶片谷氨酰胺合成酶活性是最低的。就季节时段而言，桉树叶中谷氨酰胺合成酶活性在初秋最高，与其他季节时段之间差异极显著（P<0.01），秋末与初春、夏季和冬季差异不显著（P>0.05），冬末与春季差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
3.1 桉树叶可溶性蛋白含量的动态分析
可溶性蛋白是高等植物中各种酶和代谢调节物的组分，同一高等植物在不同的发育期中可溶性蛋白含量也存在高低变化[12]。如花生的花针期、结荚期和饱果期叶片中的可溶性蛋白含量呈现出低-高-低的动态变化趋势[13]。桉树叶中可溶性蛋白在2015年下半年逐渐降低，次年上半年先升后降。其原因可能是2015年下半年桉树叶生长进入缓慢期，其合成蛋白的能力逐渐下降，生长所需蛋白含量大于贮存量，从而出现蛋白含量逐渐降低的现象。而2016上半年桉树叶开始进入生长旺盛期，各个生理反应活跃，蛋白质开始分解。在分解蛋白质之前，叶片中的营养物质处在一个准备阶段，营养物堆积，因此可溶性蛋白呈现出先升后降的变化趋势。桉树在生长季节需要大量的氮素，贮藏的蛋白质会转变成可溶性蛋白而分解，以补充氮素，所以桉树叶在春末可溶性蛋白会迅速降低，也可能是新梢叶片逐渐增多，其合成有机物的能力尚未活跃，蛋白质的合成能力也尚未增强，使此时可溶性蛋白含量处在一个较低水平；夏季桉树叶生长进入活跃期，叶片的各个生理机能增强，合成有机物增多，氮化物合成可溶性蛋白的含量也随着增多；进入秋季后，叶片各个生理反应能力逐渐减弱，合成的可溶性蛋白也相对减少，此时叶片的生长消耗量大于合成量，可溶性蛋白含量呈现出降低的变化趋势；冬季叶片生长缓慢，可溶性蛋白含量的消耗量变小，其贮存量逐渐增多；在冬末，叶片为下一轮的生长做准备而把蛋白质大量贮存起来，因此可溶性蛋白含量急剧增多。
3.2 桉树叶谷氨酸合成酶活性的动态分析
高等植物体不同部位或相同部位在不同的发育阶段，对氮化物需求量都不相同。如种子成熟时，它得到的氮素大部分是运输系统运来的酞胺、脲和精氨酸等化合物，这些物质大部分需要将氮释放出来，再依靠谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶同化，转化成相关的合成贮藏蛋白所需的氨基酸。根吸收氮素主要是靠迅速向地上的输导系统运输，茎和枝仅仅是氮素的转运站和通道；而高等植物体内同化作用的主要器官是叶片，生长发育前期储存氮素的主要场所也是叶片[14]。谷氨酸合成酶是谷氨酸合成的关键酶，可以提高高等植物氮素的利用率，谷氨酸合成酶在衰老的叶片中高度表达会提高高等植物氮素的再利用、加速生长和减少氮素的损失[15]。谷氨酸合成酶的活性随着含氮量的增加而提高，氮素充足有利于增加酶蛋白量，从而促进酶的活性[16]。2015年下半年谷氨酸合成酶活性较高的原因可能是桉树在这两个季节中正处在生产发育迟缓期，正要积累较多有机物，为次年生长作准备，所以此时叶片中的氨同化作用较强，谷氨酸合成酶活性也随之相应提高，氮素的贮备变多。2016年上半年谷氨酸合成酶活性降低是因为桉树在春季生长旺盛期，新梢叶片增多，叶片中的有机物、氮化物等的积累量还很少，氮元素的转移还没有完全，因此2016年4月桉树叶中谷氨酸合成酶活性较低。
3.3 桉树叶谷氨酰胺合成酶的动态分析
谷氨酰胺合成酶是高等植物氨同化的关键酶，在高等植物氮代谢过程中起着重要作用[17]。理论上来说，在春季，桉树正处于生长旺盛时期，氨同化水平应该是处在一个很活跃的状態中，植物吸收环境中的NO3-和NH4+合成氨基酸与蛋白质等有机化合过程都很活跃，谷氨酰胺合成酶的活性应该处在一个极高的水平上。然而，在试验测定中，春季桉树叶谷氨酰胺合成酶活性处在一个较低的水平上，而在秋冬季节，谷氨酰胺合成酶的活性反而处在一个较高的水平上。在2015年的7月采样时发现桉树枝条上结有果实，观察发现果实已成熟。鉴于此，可能是因为桉树在秋冬季节果实已经完全发育成熟，在种子成熟时期，种子得到的氮素主要是靠运输系统来转运酞胺、脲和精氨酸等化合物，它们大部分需要将氮释放出来，然后由谷氨酰胺和谷氨酸同化，转化成其他的合成贮藏蛋白所需的氨基酸，所以谷氨酰胺合成酶的活性显著升高。春季谷氨酰胺合成酶活性比秋季低，其原因可能是春季新梢叶片的增多，氮元素还未来得及从老叶中转移到新叶里进行氮素代谢，其本身的蛋白质、氨基酸等有机物的含量少，各个生理反应还不够活跃，从而表现出谷氨酰胺合成酶活性处在很低的状态。
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