对照的萌发率（68.96±3.01）%、花粉管长度（295.41±26.51） μm；添加NAA后，萌发率（72.32±3.74）%比对照略有增加，花粉管长度（277.61±13.81） μm有所降低；添加2，4-D、6-BA均抑制了大豆花粉萌发。因此在培养基中加入合适浓度的GA3对大豆花粉萌发有促进作用。
2.2 大豆花粉萌发主要影响因素的确定
利用Design-Expert软件对Plackett-Burman试验结果（表4）进行分析，得到响应值（花粉管长度）与各因素间的回归模型：
式中：y为花粉管长度的预测值，x1、x2、…、x8为自变量编码值。
由表5可知，该模型极显著（P<0.01）；模型的调整确定系数为R2Adj=0.961 4，说明该模型能解释96.14%响应值的变化，试验误差小，因而该模型是合适的。x1、x5、x6为显著影响因素（P<0.05），且均为正效应，因此选取这3个因素的中心水平为原点进行下步优化。x3为负效应，取低水平值；其他因素取中间水平。
2.3 最陡爬坡试验
根据模型（1），得出x1、x5、x6的最速增长步长，由此形成12个试验点的最陡爬坡试验方案，实施结果见表6。由表6可以看出，直到第10个试验点响应值都是增加的，以后花粉管长度逐渐减小，说明花粉萌发的最优条件在蔗糖18.75%、GA3 62 mg/L、初始pH值为6.5附近区域，因此采用RSM拟合新的二阶模型进一步优化。
2.4 响应面法优化培养条件
2.4.2 响应面交互作用分析及优化 RSM图形是响应值（y）对各试验因素x1、x5、x6所构成的三维空间曲面图，从RSM分析图上可以找出最佳参数以及各参数之间的相互作用，从RSM等高线图上可以直观地反映出各因素对响应值的影响，从而分析各交互作用对花粉管长度的影响。
由图3、图4、图5可以看出，蔗糖浓度、GA3浓度、初始pH值各因素之间存在着明显的交互作用，且在低水平范围内，同时升高各因素可以提高花粉管生长量；提高过大会抑制花粉管生长。通过对模型（2）求导和解逆矩阵，可以得到模型的极值点：蔗糖19.2%、GA368.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、温度25 ℃、时间 3 h，此时模型预测的最大响应值为394.56 μm。采用上述优化条件进行培养验证试验，得到花粉管长度为 391.95 μm，与预测值相近，证明该模型能较好地预测花粉管生长；优化后花粉萌发水平（花粉管长度391.95 μm）比优化前（花粉管长度295.41 μm）提高32.68%。
3 结论与讨论
植物花药中花粉发育过程积累的淀粉是其萌发时重要的能量来源，淀粉积累的程度也可作为衡量花粉成熟的标志之一[22]。但在离体培养环境下，只具备内源的能量供给时难以完成花粉萌发和花粉管生长的过程，还需要通过人工技术尽量满足植物激素、pH值、温度等条件。对于一些自然环境下花粉难以萌发的珍贵物种，要以人工手段模拟甚至超越自然条件才能辅助其完成生殖过程。因此对于花粉离体培养萌发中涉及的各种因素及其重要性，需要进行系统地分析优化。生物过程优化常用单因素法、正交法。单因素法只针对某一因素的影响，常用于确定某一因素的范围，不能反映多因素的综合效应，难以取得优化的最佳结果。正交法研究多因素多水平组合是一种高效率、经济的试验方法，但只能对孤立的试验点进行分析，考虑因素之间的交互作用时，正交试验次数会大大增加。单因素试验确定初始培养条件后，采用Plackett-Burman设计法，可以用较少的试验次数从众多相关影响因素中筛选出主要影响因素，为进一步的优化试验指明方向。响应面分析法是1951年Box-Wilson开发的一种用于化学过程因子优化的综合性方法，采用多元二次回归模型的方法，拟合各因素与响应值之间的函数关系，可连续地对试验的各个水平进行分析，能快速对主要影响因素进行优化和评价，用于研究多因子系统中因子交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件[23]，是降低开发成本、优化试验条件、提高生产效率、解决实际生产问题的更为有效的方法。近几年，响应面法不仅在化学工业、生物学、医学以及生物制药领域得到广泛应用，而且在食品学、工程学、生态学等方面也得到了应用[24]。同时，响应面法不仅用于各行业的优化，还可以用于动力学常数的确定、酶稳定性、动力学研究。本试验采用Plackett-Burman设计法、最陡爬坡路径法和响应面分析法（RSM）中的Central-Composite设计相结合，对大豆花粉萌发的影响因素进行研究，确定了培养基中添加蔗糖、CaCl2、GA3可以促进花粉萌发；并筛选出蔗糖、GA3、初始pH值为影响花粉萌发的主要因素，且三者均为正效应。响应面法确定最佳培养条件为：蔗糖浓度19.2%、GA3浓度68.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、温度25 ℃、时间3 h，此条件下，花粉管长度达391.95 μm，比优化前 295.41 μm 提高32.68%。
参考文献：
[1]赵丽梅，孙 寰，黄 梅，等. 大豆结实率与花粉败育率之间的关系[J]. 大豆科学，2004，23（4）：249-252.
[2]宋淑波，刁艳辉，董金秋. 大豆杂交结实率低的原因及应对措施[J]. 现代化农业，2009，31（6）：11.
[3]董德坤，高 莎，刘乐承，等. 大豆质核互作雄性不育研究进展[J]. 中国农学通报，2012，28（15）：5-9.
[4]孙 寰，赵丽梅，王曙明，等. 大豆花粉育性分类标准的研究[J]. 大豆科学，2006，25（4）：339-343.
[5]刘忠松，官春云，陈社员. 植物雄性不育机理的研究及应用[M]. 北京：中国农业出版社，2001：12-18.
[6]孙 颖，孙大业. 花粉萌发和花粉管生长发育的信号转导[J]. 植物学报，2001，43（12）：1211-1217.
[7]Zhang H，Liang W，Yang X，et al. Carbon starved anther encodes a MYB domain protein that regulates sugar partitioning required for rice pollen development[J]. The Plant Cell，2010，22（3）：672-689.
[8]程云清，张 奇，刘剑锋，等. 外源乙烯调控大豆花粉育性的研究[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2014，40（1）：25-32.
[9]张绍玲，陈迪新，康 琅. 培养基组分及pH值对梨花粉萌发和花粉管生长的影响[J]. 西北植物学报，2005，25（2）：225-230.
[10]Wasser S P. The design of optimum multi factorial experiments[J]. Biometrika，1946，33（4）：305-325.
[11]陈 合，陈世伟，李串娜，等. PB 法筛选保加利亚乳杆菌增殖培养基的研究[J]. 陕西科技大学学报：自然科学版，2014，32（2）：101-104.[HJ1.68mm]
[12]Li Y，Liu Z，Cui F，et al. Application of Plackett-Burman experimental design and doehlert design to evaluate nutritional requirements for xylanase production by alternaria Mali ND-16[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，77（2）：285-291.
[13]刘代新，宁喜斌，张继伦. 响应面分析法优化副溶血性弧菌生长条件[J]. 微生物学通报，2008，35（2）：306-310.
[14]Trupkin S，Levin L，Forchiassin F，et al. Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2003，30（12）：682-690.
[15]金文林，王 媛，濮绍京，等. 小豆花粉生活力的初步观察[J]. 北京农学院学报，2003，18（1）：1-6.
[16]张 璐，乔旭光，刘晓宇，等. 响应面法优化姜脯糖煮液活性炭脱色工艺[J]. 中国农业科学，2013，46（14）：3072-3078.
[17]薛晓敏，王金政，张安宁，等. 植物生长调节物质对桃花粉萌发和花粉管生长的影响[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（4）：123-127，134.
[18]徐向宏，何明珠. 试验设计与Design-Expert、SPSS应用[M]. 北京：科学出版社，2010：194-203.
[19]Liu C，Liu Y，Liao W，et al. Application of statistically-based experimental designs for the optimization of nisin production from whey[J]. Biotechnology Letters，2003，25（11）：877-882.
[20]甘 露，崔松松，倪敬田，等. 纳豆固态发酵条件优化[J]. 食品工业科技，2013，34（17）：210-213.
[21]杨文雄，高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂，2005（2）：68-71.
[22]Datta R，Chamusco K C，Chourey P S. Starch biosynthesis during pollen maturation is associated with altered patterns of gene expression in maize[J]. Plant Physiology，2002，130（4）：1645-1656.
[23]李 孱，白景华，蔡昭铃，等. 细菌素发酵培养基的优化及动力学初步分析[J]. 生物工程学报，2001，17（2）：187-192.
[24]李春慧，蒲万霞，吴 润，等. 响应面法对啤酒酵母菌制剂培养条件的优化[J]. 中国兽医科学，2014，44（10）：1095-1100.