对照，6个重复，35 ℃、180 r/min进行发酵，72 h时进行还原糖浓度和乙醇浓度检测。每个处理的6个重复样品中两两混合，形成3份混合样品，随后取每份样品进行总糖浓度检测；以未发酵过的发酵培养基为对照。按DNS显色法检测还原糖浓度[12]；以浓度为0、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的木糖作标准曲线，随后对样品进行原糖浓度测定；混合样品经蒸馏后用酒精计法测定[13]。
1.7 苎麻脱胶
分别将初始菌株Ym68和工程菌株PAP16分别接种于肉汤培养基中，35 ℃、180 r/min培养菌株过夜作为菌种（OD600 nm为1.5左右）。以加肉汤培养基为对照，分别用Ym68和PAP16菌种进行脱胶试验，称取每份15 g的苎麻放于500 mL三角瓶中用于脱胶试验，35 ℃、150 r/min培养8 h，每个处理3个重复。脱胶效果根据11分级[14]，经清水洗去可溶性物质并烘干后计算脱胶前后的干物质损失率。
1.8 菌液涂片显微观察
Ym68转化pACYCDuet-1空质粒的菌株命名为Ym68-K。将Ym68、Ym68-K和PAP16菌株分别接种于肉汤培养基中，35 ℃、180 r/min转速恒温摇床培养过夜。培养好的菌液立即用于涂片，用结晶紫染色后用显微镜观察、拍照。
2 结果与分析
2.1 pACYCDuet-1-PDC-AdhB载体的构建
利用XhoⅠ单酶切位点在多克隆位点MCS2上插入的PDC基因长度为1 707 bp，而在多克隆位点MCS1上插入的AdhB基因为1 152 bp，如图1所示。将两个基因插入pACYCDuet-1载体质粒后，提取质粒用XhoⅠ和SalⅠ双酶切。结果表明，1 500～2 000 bp间存在一条目的条带，而约1 000 bp处也存在一条目的条带，分别与PDC和AdhB基因大小相符，如图2所示。而在3 000～5 000 bp间有一条较亮的条带，在约500 bp处还有一条弱带，这两条带与原始质粒双酶切位置大小相符。结果表明，pACYCDuet-1-PDC-AdhB表达载体构建成功。
2.2 PAP16具有木糖发酵能力
对Ym68转化pACYCDuet-1-PDC-AdhB质粒后，随机对5号、6号、16号和20号阳性单菌落进行PCR鉴定。单菌落与带有pACYCDuet-1-PDC-AdhB质粒的大肠杆菌DH5α扩增的条带大小一致，与预期载体构建后MCS1-F 和MCS2-R引物间的产物长度（约3 300 bp）相符；而原始菌株Ym68则未扩增出该条带，如图3所示。结果表明，带有pACYCDuet-1-PDC-AdhB质粒的Ym68工程菌株构建成功，16号菌株命名为PAP16。
用Ym68和PAP16菌株对含有5%木糖的发酵培养基进行发酵试验。从发酵后的还原糖浓度看，PAP16和Ym68对木糖的利用率基本相似。72 h发酵的Ym68菌株发酵液中还原糖浓度约为0.56%，而PAP16菌株发酵液的还原糖浓度约为0.23%；未经发酵的发酵培养基还原糖浓度为5.22%。从乙醇产量方面看，PAP16菌株发酵液乙醇浓度约为1.6%，而Ym68菌株的在0.2%以下；未发酵的培养基则未量出读数，如图4所示。结果表明， Ym68原始菌被改造成PAP16后虽然对木糖利用率的影响不明显，但发酵生成乙醇的能力提高。
2.3 PAP16苎麻脱胶性能
为检验PAP16的脱胶能力，通过苎麻脱胶试验对比Ym68和PAP16脱胶性能，结果如图5所示。只加培养基处理的对照无脱胶效果，干物质损失率在1%以下；Ym68菌株的脱胶级数达到10级，干物质损失率为12%左右；而PAP16脱胶级数为7级，干物质损失率为8%左右。从试验重复结果看，PAP16菌株的脱胶能力稍有减弱。在菌株的培养过程中发现，静置后的PAP16菌液相比Ym68更容易出现菌体沉淀。因此，对悬浮后的菌液涂片观察，PAP16菌液中菌体呈凝聚状态，而Ym68和转化有pACYCDuet-1空质粒的Ym68-K菌液其菌体则比较分散（图6），PAP16的菌体凝聚特性可能影响了其脱胶性能。
3 小结与讨论
脱胶菌株Ym68具有优良的苎麻脱胶性能，PDC和AdhB基因构建进去后其获得了发酵木糖产乙醇的能力。Ym68菌株属于欧文氏菌属，而欧文氏菌一般均可利用戊糖和己糖[15，16]，试验结果也证明Ym68菌株可以利用木糖。其发酵液乙醇浓度小于0.2%可能是误差形成的结果，而并非真正产生乙醇。PAP16发酵液中乙醇浓度达到1.6%、糖醇转化率达到24%，说明将丙酮酸脱羧酶基因PDC和乙醇脱氢酶基因AdhB引入Ym68菌中使其获得了将木糖转化乙醇的能力。已早有类似研究报道，整合PDC和AdhB基因的大肠杆菌，其产生乙醇的能力也是从无到有[17]。这些说明Ym68菌株本身具有吸收木糖的能力，但引入PDC和AdhB基因后使得木糖代谢往乙醇产物方向转化。引入PDC和AdhB基因可能改变了Ym68菌体表面特征使得该基因工程菌容易形成凝聚，从而降低了其脱胶性能。通过改造代谢途径使得麻类预处理菌株获得利用木糖转化成乙醇产物的能力，这对研究提高麻类原料利用率和推进麻类燃料乙醇技术提供了可借鉴的依据。
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